流式细胞技术和流式细胞仪.ppt

第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 当激光光束与细胞正交 时，一般会产生两种荧光信号。一种是细 胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号， 称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧 光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光 信号，通过对这类荧光信号的检测和定量 分析能了解所研究细胞的性质和数量。 第三十页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 （1）荧光信号线性测量和对数测量 线性放大器的输出与输入是线性关系，细 胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的 测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表 面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大 器。 第三十一页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 （2）荧光信号的面积和宽度 荧光信号的面积是采用对荧光光通量进 行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用 面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光 脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。 荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。 第三十二页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 （3）光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光受激光激发而发 射两种不同波长的荧光时，理论上可选择 滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测， 但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽 发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不 相同，但发射谱范围有一定的重叠。 第三十三页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 从右图中可以看 出，阴影为探测器检 测光谱的范围，FITC 探测器会探测到少量 的PE光谱，而PE探测 器则检测到较多的 FITC光谱。 第三十四页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 图中点A通过透镜f 成像在A’处，而点B通 过透镜f成像在B’处。 在光电倍增管前放上一 小孔，作为空间滤波器， 排除其它杂散光信号， 从而确保了A点光源进不 了B’点处，B点光源也 进不了A’点处。 第三十五页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （五）细胞分选器 1．小水滴的形成 压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。 喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的 数目。当喷嘴直径为50μm时，信号频率 为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若每 秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个 水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆 为空白。 第三十六页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （五）细胞分选器 2．逻辑电路 为了分选细胞，需要细胞在经过测量 区时判断出哪个细胞满足了分选的条件， 并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉 冲发生器，使之产生充电脉冲。 第三十七页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （五）细胞分选器 3．水滴的充电与偏转 当水滴从流束上将要断开时给整个流 束充电，则水滴从流束上断开后便带有同 极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一 对平行板电极形成的静电场时，带正电荷 的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可 用容器收集水滴。 第三十八页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （六）FCM测量数据的存贮、显示与分析 目前FCM数据的存贮的方式均采用列表 排队(List Mode)方式。目前FCM所采用的 都是多参数指标，荧光标记物参数数量在 逐渐增多。采用List Mode方式可大量节 约内存和磁盘容量。 第三十九页，共七十四页，2022年，8月28日 第三节 流式细胞仪的主要性能指标 一、荧光测量灵敏度 二、仪器的分辨率 三、前向角散射光检测灵敏度 四、FCM分析速度 五、FCM分选指标 第四十页，共七十四页，2022年，8月28日 第三节 流式细胞仪的主要性能指标 一、荧光测量灵敏度 灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱 荧光信号的重要指标。一般以能检测到 单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子 数目来表示，现在的FCM均可达到检测小 于100个荧光分子的指标。 第四十一页，共七十四页，2022年，8月28日 第三节 流式细胞仪的主要性能指标 二、仪器的分辨率 分辨率是衡量仪器测量精度的指标， 通常用变异系数CV(Coeffic