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DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书作者: Allanflying (站内联系 TA) 发布: 2012-09-11 一．利用 DNeasy? Blood Tissue 试剂盒提取样本总 DNA 1．前处理： 注意： 石蜡包埋组织的 DNA 一般小于 650bp，还要视样本类型与保存年限而定。 固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。 溶解时间随样本类型和溶解状态而定。 产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ul 的 AE 缓冲液洗脱纯化的 DNA。 开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤 9）。 石蜡包埋组织的前处理操作步骤： 将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入 2ml 离心管中（自备）。 加入 1200ul 的二甲苯，用力涡旋震荡。 最大转速室温（15-25°）离心 5 分钟。 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。 往沉淀中加 1200ul 的（96-100%）酒精（目的是洗去剩余二甲苯），轻柔地震荡。 最大转速室温（15-25°）离心 5 分钟。 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。 重复一次步骤 5-7。 37°孵育 10-15 分钟，孵育过程打开离心管盖，直到酒精蒸发干净。 加入 180ul 的 ATL 缓冲液，继续提取组织总 DNA 中的步骤 2。 福尔马林组织的前处理操作步骤： 用 PBS 润洗组织样本（小于 25mg）两次（目的是去除固定剂）。 去 PBS，继续提取组织总 DNA 中的步骤 1. 动物组织总 DNA 的提取 注意： ATL 缓冲液和 AL 缓冲液可能存储后沉淀，如果沉淀，在56°孵育直至沉淀溶解。 在 AW1 缓冲液和 AW2 缓冲液中加入一定量（见瓶身）的（96%-100%）酒精，然后才使用。 打开水浴锅至 56℃，用于步骤 2。 如果是冻存的样本，拿出来室温预热，避免反复冻融。操作步骤： 取 25mg 组织，切成小块，放入的离心管中。加入180ul 的 Buffer ATL。 加入 20ul 的蛋白酶 K。涡旋震荡（5-10S）。56℃孵育直至组织消化完全，一般为 1-3 小时。偶尔间断的拿出震荡。 涡旋震荡 15S，加入200ul 的 Buffer AL,涡旋充分混匀。加入200ul 的（96%-100%） 的酒精。涡旋充分混匀。（注：样多时可将 AL 和酒精预混以节省时间） 转移步骤 3 中的所有混合液至 DNeasy Mini spin 离心柱，柱子放在 2ml 的收集管上（已提供），≧6000g（8000rpm）离心 1 分钟。弃收集管/液。 将离心柱放在一个新的 2ml 收集管上（已提供）加 500ul 缓冲液 AW1，≧6000g （8000rpm）离心 1 分钟。弃收集管/液。 将离心柱放在一个新的 2ml 收集管上（已提供）。加 500ul 缓冲液 AW2，20000g （14000rpm）离心 3 分钟。弃收集管/液。 将离心柱放在一个新的或 2ml 离心管（自备）上，吸200ul 的缓冲液 AE 在吸附膜上，室温 1 分钟，≧6000g（8000rpm）离心 1 分钟。 为增大 DNA 产量，重复步骤 7（注意：从离心管中吸取液体反复洗脱）。 动物血液或细胞中提取 DNA 1） 取 50-100ul 的抗凝血至或 2ml 离心管中（自备），加 20ul 蛋白酶K，用 PBS 补加至 220ul。 2) 加入 200ul 缓冲液 AL，涡旋震荡充分混匀，56℃孵育 10min。3）加入 200ul 的（96%-100%）酒精，涡旋震荡充分混匀。 移取步骤 3 的混合液至离心柱上，离心柱放在 2ml 收集管上（已提供）。≧6000g（8000rpm）离心 1 分钟。弃收集管/液。 离心柱放至新的2ml 收集管上（已提供），加 500ul 的缓冲液 AW1，≧6000g（8000rpm）离心 1 分钟。弃收集管/液。 离心柱放至新的2ml 收集管上（已提供），加 500ul 的缓冲液 AW2，20000g（14000rpm）离心 3 分钟。弃收集管/液。 将离心柱放在一个新的或2ml 收集管（自备）上，吸200ul 的缓冲液 AE 在吸附膜上，室温 1 分钟，≧6000g（8000rpm）离心 1 分钟。 为增大 DNA 产量，重复步骤 7（注意：从离心管中吸取液体反复洗脱）。