大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFPSNAT3融合蛋白的表达与鉴定.docxVIP

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFPSNAT3融合蛋白的表达与鉴定作者：李敏闵伟勇张舟来源：《上海师范大学海报?自然版》2014年第02期 摘要：SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3（SNAT3）是SystemN中的一员.它在大脑谷氨酸谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位，本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与SNAT3的N末端连接，通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV（△[1098-1300]）-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞（HEK293Tcells），利用激光扫描共聚焦显微镜和Westernblot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明，EGFP-SNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能. 关键词：增强型绿色荧光蛋白；EGFP-SNAT3融合蛋白；质粒构建；表达鉴定 中图分类号：Q31文献标识码：A文章编号20140引言 Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白（SodiumcoupledNeutralAminoAcidTransporters，SNATs）属于SLC38基因家族.根据功能特性和调控模式，SLC38家族分为SystemA和SystemN两个亚型，其中SNAT1、SNAT2、SNAT4属于SystemA；SNAT3、SNAT5属于SystemN[1-4].SNAT1和SNAT3是SLC38家族中首先发现的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白[4-6].除了SNAT4夕卜，SLC38家族中的成员均偏爱转运L-谷氨酰胺[1]. 谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是人血浆中浓度最高的氨基酸[7]，系统性的Gln缺乏将引起多系统疾病和致命的多器官功能衰竭[8],作为蛋白质的组成成分之一，Gln在胚胎的生长过程中有着多重作用[9],它参与了柠檬酸循环、核苷酸和蛋白质的生物合成以及氨代谢，也是神经递质Y-氨基丁酸（GABA）和抗氧化剂谷胱甘肽的前体物质[10].在大脑和肝脏中，由谷氨酰胺合成酶合成Gln是氨代谢中的关键环节[11].Gln通过谷氨酸-谷氨酰胺循环为大脑兴奋性神经递质谷氨酸的合成提供底物，参与大脑能量代谢，直接关系到大脑的兴奋性和抑制性调控[12-13].胎盘中也存在谷氨酸-谷氨酰胺循环，Gln从胎盘释放进入胎儿的血液循环，提供胎儿生长所需的氨基酸[14-15].Gln发挥以上这些作用均离不开转运蛋白的协助，而在Gln的摄取和释放过程中，SLC38家族的成员SNAT3扮演着关键角色. SNAT3由SLC38A3基因编码，主要定位于星形胶质细胞的细胞质膜上［4,16］,为SystemN中的标志性成员.SNAT3对pH敏感［17］，它通过反向转运一个H+的方式共转运氨基酸［4，18-20］,研究发现，SNAT3和SNAT5共同起作用，在大脑中参与谷氨酸-谷氨酰胺循环，介导Gln从星形胶质细胞输出［5,16,20-21］，这是胶质细胞和神经元之间谷氨酸-谷氨酰胺循环的关键一步,已有报道表明，SNAT3是Gln从星形胶质细胞输出的主要推动者［4，19］.在伯格曼神经胶质细胞(BGC)中，SNAT3和GLAST/EAAT1相互作用，介导Gln的输出［22］，这一生理过程也可以为抑制性神经递质GABA的生物合成提供Gln［23-24］,SNAT3通过介导Gln的输出还参与了大脑、肝脏的氨解毒过程［4，5，25］，以及大鼠肾脏的酸中毒反应［26］,SNAT3在分离的人类原始滋养层细胞中也有表达，表达量会随后者分化成合胞体滋养层细胞而降低；胚胎发育早期，SNAT3可为胚胎提供Gln，并随妊娠的进展，其表达水平呈显著下降的趋势［7］. 鉴于SNAT3在各种生理和病理活动中的重要性，深入探索SNAT3的结构和功能具有重要意义.目前，将一些标签蛋白与目的蛋白构建在一起，通过标签蛋白与目的蛋白的融合共表达来研究蛋白质的表达与定位的方法受到了越来越多研究者的亲睐绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)最早从维多利亚水母体内克隆得到，大小为27kDa，它在蓝光或紫外光的激发下可产生清晰明亮的绿色荧光，且荧光有抗光漂白作用，很容易与自身荧光区别增强型绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)是一种优化的GFP的突变体，与GFP相比具有更强的荧光信号，是一种通用的分子标签. 本研究采用三片段连接的方法将EGFP连接到了真核生