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upa、mmp-9在大鼠矽肺组织中的表达及相关性研究 岩肺是一种广泛存在于长期二氧化硅灰尘中的全身疾病，主要是肺组织的慢性纤维。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及基质金属蛋白酶(MMP-9)在肺炎症及纤维化的形成中扮演着重要的角色,在矽肺纤维化中可能存在uPA诱导的纤溶系统活化与MMP介导的纤维化通路的交互作用,研究uPA、MMP-9在大鼠矽肺纤维化中的作用机制可为矽肺的早期诊断、治疗提供新的思路。 1 材料和方法 1.1 模型分组与试剂 Wistar大鼠60只,体质量为180~220g。由山东大学动物实验中心提供,许可证号:SCXK(鲁)2005-0015。随机分为模型组与对照组,每组30只。二氧化硅(SiO２)由威佳科技有限公司提供(美国Sigma公司),配制成50mg/ml的矽尘混悬液。兔抗大鼠uPA多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司, 工作浓度为1∶50; 兔抗人MMP-9由美国Santa Cruz公司提供,工作浓度为1∶60;SP免疫组化试剂盒为北京中山生物技术有限公司提供,为即用型。 1.2 免疫组化显色模型 1.2.1 动物模型的建立0.4%戊巴比妥麻醉大鼠,仰卧位固定,颈部消毒,暴露气管,将1ml矽尘混悬液缓慢注入气管后,立即将动物直立并旋转,使液体在左右两肺均匀分布。同法对照组大鼠气管内注入1ml灭菌生理盐水。模型建立后,每组分别在第1、第3、第7、第21、第28天取5只大鼠处死。取出肺组织用10% 甲醛固定,脱水石蜡包埋。经HE染色显示,正常肺组织结构大部遭到破坏;结节主要由吞噬矽尘颗粒的泡沫细胞、成纤维细胞以及上皮样细胞组成,则表明模型成功［１］。 1.2.3 结果判定免疫结果半定量判断参照免疫组化显色标准略修改［２］:按显色程度分弱、中、强3种,分别用+、++、+++表示。每个标本每个指标,取5 个较好的高倍视野,按显色范围分为:(1)+为显色范围占高倍视野1/4;(2)++为显色占高倍视野1/4~2/4;(3)+++为显色占高倍视野2/4~3/4。并将每个高倍视野显色程度和范围换算成 “显色指数”,显色指数=显色程度×显色范围(+为1、++为2、+++为3),取其均数为每个检测指标的最终显色指数。 1.3 均数转换方差齐 用SPSS 11.0统计软件,计量资料的均数比较以ue0af±s表示(方差齐);方差不齐者将数据进行对数转换后以ue0af±s表示。以P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 肉芽肿的分离纯化 对照组各时间点肺组织结构基本正常,炎症反应轻微,支气管周围淋巴细胞反应性增生。由图1可见,染矽尘组,注入矽尘后第3天,巨噬细胞在肺泡腔内聚集,肉芽肿结节开始在肺泡腔内形成;第7天,小肉芽肿弥漫存在,并融合成较大的肉芽肿;第14天,肉芽肿进行性纤维化,成纤维细胞增生并平行排列,可见巨噬细胞、浆细胞、嗜酸粒细胞及反应性肺气肿;第28天,可见巨大纤维性结节,纤维化损害进一步扩大,甚至占满整个肺叶,正常肺组织结构大部分遭到破坏。 2.2 染尘时间和时间对upa蛋白表达的影响 对照组肺组织可见uPA、MMP-9蛋白表达,主要分布在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞中,阳性反应物质呈棕黄色,细胞质着色,但表达强度均较弱。 由图2可见,染尘组uPA的阳性表达明显增多,且随染尘时间的延长,uPA蛋白表达呈增强趋势,至第1周时达高峰,主要分布在中性粒细胞及肺泡巨噬细胞中;此后逐渐减少,但在第4周时仍较对照组明显,以肺组织结节内阳性表达为主,染尘各组蛋白表达与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。MMP-9 蛋白阳性表达较对照组明显增多,且随染尘时间的延长,表达强度也逐渐增强,至第1周达高峰,此后呈减弱趋势,染尘第4周时染色阳性细胞较第1周时明显减少,但仍明显高于正常肺组织。染尘各组MMP-9蛋白表达与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。 2.3 染尘组mmp-9的表达特点 随着染尘时间的延长,uPA蛋白阳性表达明显增多,至第1周时达高峰,此后逐渐减少,但在第4周时仍多于对照组,以肺组织结节内阳性表达为主,染尘各组其蛋白表达显色指数与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。由表1 可见,染尘组从第1天起即可见MMP-9在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞中的表达,随着染尘时间延长,其阳性表达逐渐增强,至第7天时最强,此后呈减弱趋势,染尘第4周时染色阳性细胞较第1周时明显减少,但仍明显高于正常肺组织。染尘各组其蛋白表达显色指数与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。将染尘组uPA、MMP-9阳性表达进行相关性分析,发现随着染矽尘时间的延长,uPA、MMP-9阳性表达均增强,二者呈正相关(P=0.0090.01)。 3 upa活性的变化 肺纤维化是肺组织对损伤的修复反应,我