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中学生物实验技能实验报告——石蜡切片的制作 PAGE 3 东北师范大学生命科学学院 中学生物实验技能实验报告 名 称：石蜡切片的制作 姓 名：路 路 学 院：生命科学学院 专 业：生物科学（师范） 年 级：10级 学 号：1241410044 【实验名称】石蜡切片的制作 【实验目的】了解石蜡切片的用途，并掌握其制作过程和方法。石蜡切片（paraffin section），组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。例如在医学上，常常用石蜡切片做病例分析和诊断。 【实验步骤及原理】石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。 以下即为石蜡标本制作的流程图： 固定取材 固定 取材 固定即是用适当的化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，使其迅速凝固或沉淀细胞核组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程，防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且有媒浸作用，有助于组织着色。 固定液可以分为单一固定液以及混合固定液。前者有甲醛、酒精、醋酸以及升汞等，混合固定液一般有Bouin氏液、Carnoy氏液等，可以互补不足。10%福尔马林（4%甲醛）或者10%磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液。 固定时间根据材料快的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，一般为数小时至24小时。 水洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 根据要求选取材料的来源和部位，取材时要求快速，定位准确，注意保持结构的完整性。 酒精是常用的脱水剂，能与水和透明剂相混。为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序（50%—100%）逐步进行。 材料块在透明剂中浸渍的过程即为透明，常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿等。透明时间依据组织材料块的大小以及属于囊腔或者实质器官而定，时间过短则透明不够彻底，时间过长则组织硬化变脆，就不易切出完整切片。 用石蜡代替透明剂，使石蜡浸入组织起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液中浸渍1~2小时，再移入纯石蜡中浸渍3小时左右。一般使用的石蜡为了增加其粘度，常将石蜡与蜂蜡以9:1的比例混合。 切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，固定在小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块面与切片刀刃平行。 贴片 贴片 脱蜡及水化 染色 脱水 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂一般是蛋白甘油。 干燥后的切片需及时水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再移至经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。 染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察，未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内容物以及不同类型的细胞组织。 根据不同观察需要和研究内容可以采用不同的染色剂和染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精和伊红染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。 经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色。其染色原理是：多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性，呈嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料有亲和性，称嗜酸性。 染色的步骤一般是：苏木精染色—水洗浮色—兰化（用自来水或者氨水，使蓝紫色更加清晰）—水洗—脱水—伊红染色。 染色后的切片尚且不能在显微镜下观察，需要经梯度酒精脱水，在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。 透明 通常使用二甲苯进行透明。 封片 透明后，滴加适量中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本。