In-Fusion克隆技术介绍.pptx

In-Fusion克隆技术介绍10/27/2023宝日医生物技术（北京）有限公司 主要内容10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍2 1In-Fusion?技术原理 3In-Fusion?应用实例 4In-Fusion?应用文献 2In-Fusion?实验方法 In-Fusion?技术原理示意图10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍3 In-Fusion酶Clontech专利50 ℃，15 min单管反应 In-Fusion?技术特点10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍4 开放性无缝克隆多片段克隆In-Fusion不受载体限制不受酶切位点限制不附加任何冗余序列一次反应单管操作阳性率高达80% 主要内容10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍5 1In-Fusion?技术原理 3In-Fusion?应用实例 4In-Fusion?应用文献 2In-Fusion?实验方法 In-Fusion?引物设计10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍6 黏性末端（5’ 悬挂）黏性末端（3’悬挂） 平末端缺失酶切位点部分碱基 In-Fusion?引物设计在线工具10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍7 在线工具网址/CN/Support/Online_Tools 片段与载体用量计算工具PCR引物转换工具 载体线性化10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍8 PCR扩增酶切处理 建立In-Fusion?连接体系10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍9 Linearized vector : Purified PCR fragment (摩尔比)=1:2*0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, 10 kb: 50-200 ng**10 kb: 50-100 ng, 10 kb: 50-200 ngRxn ComponentCloning Rxn5× In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μlLinearized vector x μl* Purified PCR Fragment x μl** ddH2O x μlTotal Volume 10 μl 主要内容10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍10 3In-Fusion?应用实例 1In-Fusion?技术原理 4In-Fusion?应用文献 2In-Fusion?实验方法 In-Fusion?应用10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍11 应用多片段克隆插入突变位点构建载体模型高通量克隆 In-Fusion?应用实例10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍12 1多片段连接实验2定点突变实验In-FusionTM assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Baogong Zhu, Guifang Cai, et al. BioTechniques, Sep 2007; 43:354-359 In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。 简便、快速、高效的克隆技术10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍13 In-Fusion?应用实例---多片段连接10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍14 多片段连接---构建真正无缝融合蛋白 将白细胞介素2(IL-2)分泌信号序列与CD101胞外域序列（删除内源性信号序列）和鼠免疫球蛋白G3(IgG3)的可结晶片段进行融合，构建无缝融合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc ，并将其转染COS细胞检测表达情况。实验流程设计引物；扩增目的片段及载体线性化；建立In-Fusion连接反应体系。 In-Fusion?应用实例---多片段连接10/27/2023In-Fusion克隆技术介绍15 引物设计并扩增目的片段IL-2 Signal, CD101和Murine IgG3 IL-2 Signal with Overlaps to NcoI-Digested Vector and CD101, 88-bp