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肠球菌对六种抗生素耐药情况的检测 肠球菌是人体肠道的正常菌群。近年来,由于广谱抗生素的大量使用,肠球菌作为条件致病菌所引起的感染率持续升高,尤其对于那些有严重基础疾病和机体免疫力低下的患者,容易侵入体内或易位,从而导致局部或全身感染。肠球菌对多种抗生素显示不同程度的耐药。1988年,耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-Resisitant Enterococci,VRE) 首次在英国伦敦分离得到。研究发现,VRE有六种不同的基因型,分别为VanA、VanB、VanC、VanD、VanE和VanG。目前,我国已分离得到VanA、VanB及VanC三种基因型。为了解肠球菌对常用抗生素的耐药性,并检测VRE基因型,特对本院所分离得到的100株肠球菌进行检测及分析,报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 临床标本的发现 来自2005年8月~2006年1月湖南中医药大学第一附属医院门诊和住院患者临床标本共计100份。其中包括尿液(34%),生殖道分泌物(29%),痰(8%),胆汁(9%),血液(4%),胸水(1%)以及其他分泌物(15%)。 1.1.2 参考推荐的细菌 VanA、VanB、VanC1及VanC2四株VRE,购自中科院微生物菌种库。 1.1.3 标准菌株 粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC25923。 1.1.4 其他抗菌素 氨苄西林(AMP 10 μg/片)、氨苄西林/舒巴坦 (AMS 20 μg/片)、万古霉素(VAN 30 μg/片)、替考拉宁(TEC 30 μg/片)、环丙沙星(CIP 5 μg/片)、庆大霉素(GEN 10 μg/片)及庆大霉素(GEN 120 μg/片)均系英国Oxoid公司产品。 1.1.5 培养基 MH琼脂购自杭州天和微生物制品公司,脑心浸液培养基自配。 1.1.6 cccactacct基因表达 聚合酶、dNTPs、DNA分子标准物购自宝生物工程公司,PCR引物VanA、VanB、VanC1及VanC2由香港中文大学微生物学系惠赠。各引物基因序列分别是VanA:5′-CAGCGGCCATCATACG G-3′,3′-GCTATTCAGCTGTACTC-5′;VanB:5′-GATGCGG AAGATACCGTGGCT-3′,3′-CATCGCCGTCCCCGAATTTC AAA-5′;VanC1:5′-CCTCCGCCATCATAGCT-3′,3′-GGTA TCAAGGAAACCTC-5′;VanC2:5′-CGCAGGGACGGTGAT TTT-3′,3′- CGCAGGGACGGTGATTTT-5′。 1.1.7 仪器 Vitek2微生物鉴定系统(法国梅里埃);PCR扩增仪(厦门安普利);电泳仪(上海西巴斯);紫外透射仪(北京六一)。 1.2 实验方法 1.2.1 识别菌株 所有实验菌株均按全国临床检验操作程序由Vitek2微生物鉴定系统鉴定。 1.2.2 k-b纸片法 挑取培养18~24 h的菌落,用无菌生理盐水稀释至菌液浓度达到0.5麦氏单位,用无菌棉签沾取适量菌液均匀涂布于10%的绵羊血平板(M-H),贴上药敏纸片。于35℃孵育24 h,用游标卡尺量取抑菌圈直径大小。K-B纸片琼脂扩散法判断标准见表1。每批实验均用金黄色葡萄球菌ATCC25923作质控。 1.2.3 庆大霉素低耐株的筛选 分别用含量为10 μg/片及120 μg/片的庆大霉素药敏纸片对试验菌株进行药敏试验,如果10 μg/片纸片抑菌环直径≤12 mm,并且120 μg/片纸片抑菌环直径≥10 mm时,被测菌株为庆大霉素低耐株;如果120 μg/片纸片抑菌环直径≤6 mm时,被检测菌株则为HLGR株。 1.2.4 菌株生长鉴定 采用ADSP法,挑取培养18~24 h的菌落,用无菌生理盐水稀释至菌液浓度达到0.5麦氏单位,无菌吸取10 μL菌液滴加于含6 μg/mL万古霉素的琼脂平板上,35℃孵育24 h。观察有菌生长者为耐万古霉素的肠球菌。每批实验用粪肠球菌ATCC29212作阴性对照,以四株VRE参考菌株作阳性对照。 1.2.5 pcr扩增dntps法 采用多重聚合酶链反应(multiplex PCR)定性试验,检测VRE的耐万古霉素基因。 细菌DNA提取:将细菌接种于LB培养基中,35℃摇床孵育过夜,取1.5 mL菌液倒入eppendof管中,12 000 r/min离心6 min,去上清,加入100 μL裂解液,混匀,37℃孵育30 min,100℃水浴2 min后,加入等体积的Tris饱和重蒸酚和氯仿,混匀,12 000 r/min离心5 min后,取上清备用。 多重PCR 反应体积50 μL,含8种(4对)引物各10 pmol,4种dNTPs各0.2 mmol/L,