实时荧光定量PCR注意事项及原理(Q-RT).pptVIP

;;;常规PCR;实时荧光定量PCR;荧光报告基团:;工作原理:;;Experimental procedure;RNA样品的质量控制;用模板初始量（或未知量样品的稀释倍数）的log值对每个稀释品的CT值作图，两者呈线性递减的关系，称之为标准曲线（至少5个数量级）。用来判定SYBR Green?I反应的效率、重复性和动态范围。;;;;绝对定量是测定靶点实际拷贝数的实时荧光定量 PCR 分析方法。需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量 PCR 扩增，利用获得的数据生成标准曲线。然后将未知样本的 Ct 值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。 ;例如：10倍稀释已知浓度的标准曲线：得 y=-3.301x+38.591 或 CT=-3.301(log quantity)+38.591未知样品的量 Quantity=10(CT-38.591)/-3.301;在相对定量中，通过归一化来确保相等数量的样品中比较目标基因的量。常用的是选择一个参照基因(如GAPDH，β-actin等)来进行相对定量，目的是弥补样本组织量的差异。 用相对定量比较多个试验样本(test)，样本之一常被选为参照作为校准样品(calibrator)，所有样本中目标基因的表达都相对于参照上调或下调，无需精确测定拷贝数，而是关注与校准样本相比的倍数变化 。;例如，研究某一小麦基因在种子中的表达水平，取开花后5个时期样品进行实验;;;;△Ct(calibrator ) =△Ct(15d)= Ct(target，15d)- Ct(ref，15d) =25.42-20.39=5.03;;;;;引物二聚体的形成 ;A1: 凝胶电泳是可显示引物二聚体。;A2: 采用熔解曲线分析可鉴别是否存在引物二聚体。 ;引物二聚体的熔解温度较扩增片段更低，在70°C 左右熔解。出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。 ;;NTC 扩增;;反应效率E过高或过低;;;待测样本反应结果在标准曲线的动态范围之外;例如：;无扩增;;;;常规PCR;实时荧光定量PCR;荧光报告基团:;工作原理:;;Experimental procedure;RNA样品的质量控制;用模板初始量（或未知量样品的稀释倍数）的log值对每个稀释品的CT值作图，两者呈线性递减的关系，称之为标准曲线（至少5个数量级）。用来判定SYBR Green?I反应的效率、重复性和动态范围。;;;;绝对定量是测定靶点实际拷贝数的实时荧光定量 PCR 分析方法。需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量 PCR 扩增，利用获得的数据生成标准曲线。然后将未知样本的 Ct 值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。 ;例如：10倍稀释已知浓度的标准曲线：得 y=-3.301x+38.591 或 CT=-3.301(log quantity)+38.591未知样品的量 Quantity=10(CT-38.591)/-3.301;在相对定量中，通过归一化来确保相等数量的样品中比较目标基因的量。常用的是选择一个参照基因(如GAPDH，β-actin等)来进行相对定量，目的是弥补样本组织量的差异。 用相对定量比较多个试验样本(test)，样本之一常被选为参照作为校准样品(calibrator)，所有样本中目标基因的表达都相对于参照上调或下调，无需精确测定拷贝数，而是关注与校准样本相比的倍数变化 。;例如，研究某一小麦基因在种子中的表达水平，取开花后5个时期样品进行实验;;;;△Ct(calibrator ) =△Ct(15d)= Ct(target，15d)- Ct(ref，15d) =25.42-20.39=5.03;;;;;引物二聚体的形成 ;A1: 凝胶电泳是可显示引物二聚体。;A2: 采用熔解曲线分析可鉴别是否存在引物二聚体。 ;引物二聚体的熔解温度较扩增片段更低，在70°C 左右熔解。出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。 ;;NTC 扩增;;反应效率E过高或过低;;;待测样本反应结果在标准曲线的动态范围之外;例如：;无扩增;