DB12∕T 1006-2020 茄子黄萎病菌土壤带菌 PCR 检测技术规程.docxVIP

ICS?65.020.01 B?16 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T?1006—2020 茄子黄萎病菌土壤带菌?PCR?检测技术规程 Technical?regulation?of?PCR?detection?for?verticillium?dahliae?in?soil 2020?-?12?-?17?发布 2021?-?01?-?16?实施 天津市市场监督管理委员会 发?布 DB12/T?1006—2020 前 言 本标准按照GB/T?1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市植物保护研究所。 本标准主要起草人：高苇、王勇、杨利娟、贲海燕、张春祥、刘晓琳、姚玉荣、王万立。 I 库七七提供下载DB12/T?1006—2020 库 七 七 w .k w. co m 提 供 下 载 茄子黄萎病菌土壤带菌?PCR?检测技术规程 1 范围 本标准规定了茄子黄萎病菌的PCR检测的仪器和试剂、土壤取样、PCR检测、结果判定、土样及资料 保存。 本标准适用于土壤中茄子黄萎病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）均适用于本文件。 GB/T?6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T?36197-2018 土壤质量?土壤采样技术指南 GB/T?36199-2018 土壤质量?土壤采样程序设计指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 茄子黄萎病菌 verticillium?wilt?of?eggplant 茄子黄萎病菌大丽轮枝菌（Verticillium?dahlia?Kleb.）可以侵染多种植物引起一种土传的维管 束病害，病菌可在土壤中长期存活，是茄果类作物生产中危害最为严重的土传病害。茄子黄萎病菌的基 本信息参见附录A。 3.2 微菌核 verticillium?wilt?of?eggplant 茄子黄萎病菌生长过程中，一条或多条菌丝体膨大、细胞壁增厚后，多向芽殖而形成的多细胞结构， 该结构为肉眼可见的黑色菌丝颗粒。 3.3 土壤带菌 soil-borne 土壤中携带能够诱发侵染植株发病的病原菌。 4??仪器和试剂 4.1 主要仪器 涡旋振荡仪、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、聚合酶链式反应仪（PCR仪）、水浴锅、电子天平（感 量0.1?g和0.1?mg）、电泳仪、凝胶成像仪。 4.2 主要试剂 1 库七七提供下载DB12/T?1006—2020 库 七 七 w .k w. co m 提 供 下 载 水饱和酚、三氯甲烷、液氮、异丙醇、无水乙醇、DNA荧光染料（Gel?Red）、Tris-HCl等。DNA分 子量标准（DNA?Marker，能够区分100?bp～1000?bp的DNA片段）。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）抽提液：2%?CTAB，100?mmol/L?Tris·Cl（pH?8.0），20?mmol/L?EDTA （pH?8.0），1.4?mol/L氯化钠。 PCR反应混合物：2×Master?Mix:?Taq?DNA聚合酶，2×PCR反应缓冲液，dNTP混合物等。 10×TAE电泳缓冲液：242?gTris-base，57.1?mL冰乙酸，100?mL?0.5?mol/L?EDTA（pH8.0）加蒸馏 水至1000?mL，使用时稀释10倍。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T?6682要求。 5 待测土壤取样 土壤采样按照GB/T?36199-2018和GB/T?36197-2018的有关要求进行，每块栽培地（面积667m2左右） 按照“S”采样法设置15个采样点，使用不锈钢土壤取样器采集0～40cm耕层土样，将所有采样点土壤混 匀后放入采样袋中。 6 检测与鉴定 6.1 土壤样品预处理 将采集的土壤样品送回实验室后，打开采样袋在室内自然风干（自然风干时间不能超过24?h），然 后采用2?mm孔径的土壤筛过滤土壤，过滤后的土样进行检测。 6.2 样品总?DNA?的提取 每个样品设置3个重复3个平行，每个重复称取1?g土样，放入灭菌的研钵中，加入液氮充分研磨。 向研钵中加入4?mL预热的CTAB抽提液，倒入15?mL灭菌离心管中，反复震荡混合后，65℃水浴30?min， 4℃?14?000?g离心10?min，保留上清液。 取上清液，加入等体积水饱和酚，充分混匀后，4℃?14?000?g离心10?min。 取上清液，加入等体积的三氯甲烷:异戊醇（24:1），4℃?14?000?g离心10?min。继续三氯甲烷: 异戊醇（24:1）抽提，直至有机相和水相之间无蛋白层为止。 吸取上清