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包涵体蛋白的提取与纯化

摘要：

随着基因重组技术的发展及越来越多的功能基因被发现和克隆,蛋白质异源表达已被广泛应用。大肠杆菌因遗传背景清楚、成本低、操作简单,且能高效表达外源基因等特点,是基础研究、临床应用及工业生产蛋白和多肽的首选表达系统。然而,重组蛋白在大肠杆菌中表达经常形成无活性的不溶性聚集物即包涵体。包涵体的形成有一定的优势,如具有高蛋白密度、易分离、易于毒性蛋白和宿主细胞致死蛋白表达等特点[1~3]。因此,如何将包涵体蛋白转变为具有活性的可溶蛋白是备受关注的问题。从包涵体中获得天然活性的重组蛋白一般包括三个步骤:包涵体的分离和洗涤、包涵体的溶解、包涵体蛋白的复性。本文综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和色谱法复性技术研究进展,期望包涵体蛋白体外折叠这一难题早日解决。

正文：

1．包涵体的形成

重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时，都可形成包涵体[4]。通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体，一般含有50%以上重组蛋白，其余为核糖体组分、RNA聚合酶，外膜蛋白等杂蛋白，以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分[5，6]。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点，所以也称为折射体(Refractilebody)[7]。包涵体形成的原因主要有以下几点:蛋白合成速度太快，以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应，而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应，因此，折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大[8]；|重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等)，致使中间体大量积累，容易形成包涵体[9]；培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成，如发酵温度高，胞内pH接近蛋白的等电点等[10]；¨二硫键在蛋白折叠中有重要作用，而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成[2]；?包涵体不溶可能由于分子间无活性的B-片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白[11]。包涵体蛋白虽然不具有天然结构、没有活性，但在基因工程中生产重组蛋白，包涵体的形成有一定优势，主要表现在:重组蛋白高水平表达，有时候可达细胞总蛋白的30%[2]；|包涵体密度高(约1。3mg/ml)[12]，重组蛋白相对较纯，很容易与细胞成分分离，可减少后续纯化步骤；包涵体结构致密，因而在一定程度上避免了大肠杆菌蛋白酶的降解；易于毒性蛋白和膜蛋白表达[3，8]；包涵体的形成降低了重组蛋白在胞质中的浓度，有利于目的基因的进一步表达。基于这些特点，重组蛋白的包涵体表达已在商业化生产中得到广泛应用。

2.包涵体蛋白的溶解和去折叠

溶解包涵体目前最常用的方法是用变性剂如尿素(6~8mol/L)或盐酸胍(4~6mol/L)溶解,它们对蛋白质的氢键有较强的可逆性变性作用,可破坏蛋白质高级结构,或伸展肽链分子之间的相互作用,使其去折叠。尿素具有不电离、成本低、可直接进行SDS检测以及溶解的包涵体蛋白可选用多种色谱法纯化等优点被广泛应用,但尿素容易析出,作用时间较长或温度较高时会对蛋白质进行共价修饰。盐酸胍溶解包涵体能力较尿素强,作用快而不修饰蛋白,但成本高,酸性条件下易沉淀,还干扰离子交换色谱等。一般来说,用低浓度变性剂溶解包涵体得到的可溶性蛋白纯度比高浓度变性剂溶解的高,是因为变性剂浓度高时胞质颗粒蛋白也被释放出来[9]。包涵体溶解还可添加去污剂[23,25]、还原剂[15,26]、螯合剂[26]等,或在极端pH、高温条件下进行[18]。各种去污剂如SDS,CTAB,Tween20,NP40,TritionX-100,Sarkosyl(月桂酰-N-甲基氨基乙酸钠)等常被用来溶解包涵体是因为其作用比盐酸胍和尿素更温和,溶解的蛋白质具有更多的有序结构,可能已经具有生物活性,避免了复性中的错误折叠。但是使用去污剂作为溶解剂可能会干扰后续纯化步骤[9]。对于含有半胱氨酸的重组蛋白质,分离到的包涵体中常含有一些链间和链内非活性的二硫键,因此还原剂的使用非常重要。常用的还原剂有DTT、DTE、GSH、B-巯基乙醇,还原剂可以过量,以保证半胱氨酸还原完全。EDTA,EGTA等鳌合剂也被用来阻止金属离子催化的空气氧化反应,硫化物的形成或二硫化物混和物也可保护被还原的半胱氨酸[27]。利用极端pH也可溶解包涵体。Gavit等[18]将低pH([2.6)和高温(85e)相结合,并通过在位溶解的方式溶解抗真菌重组多肽包涵体。

3．体外辅助蛋白