谷丙转氨酶的测定.docx

实验九血清谷丙转氨酶的测定

一、 实验目的

掌握比色分析法测定血清谷丙转氨酶活性的原理；

熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的方法；

了解血清谷丙转氨酶测定的临床意义。

二、 原理

血清谷丙转氨酶（S、G、P、T）作用于丙氨酸及a一酮戊二酸，结果生成谷氨酸与丙酮酸。丙酮酸与2,4—二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。

GPT

a一酮戊二酸+丙氨酸 ?谷氨酸+丙酮酸

丙酮酸+2.4一二硝基苯肼 丙酮酸二硝基苯腙

（红棕色）

三、操作

15X25mm中试管4支，标号，按下表操作:

-- 管号

试剂（ml）

标准管

标准空白管

测定管

测定空白管

丙酮酸标准液（100ug/ml）

0.1

—

—

—

新鲜血清

—

—

0.1

0.1

底物液（在37°C保温过）

0.5

0.5

0.5

—

磷酸盐缓冲液

—

0.1

—

—

前三管置于37C保温30分钟

2.4二硝基苯肼

0.5

0.5

0.5

0.5

底物液

—

—

—

0.5

充分混合，置于37C保温20分钟

0.4N氢氧化钠

5.0

5.0

.0

5.0

静止10分钟后，选用520nm的单色光，以蒸馏水调零，测定各管光密度。

四、计算

本法所规定的谷丙转氨酶活性单位的定义是：1ml血清于37°C与底物作用30分钟，产生2.5ug丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。

测定管光密度一测定空白管光密度 1 1

血清谷丙转氨酶= X10X—X—

标准管光密度一标准空白管光密度 0.1 2.5

测定管光密度一测定空白管光密度

= X40（SGPT活性单位）

标准管光密度一标准空白管光密度

正常值：2?40单位/ml血清。

注意：

2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，a-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼作用而现色。此外，2,4-二硝基苯肼本身也有类似的颜色，因此空白管颜色较深，吸光度常在0.18左右。

可用小白鼠肝匀浆（20倍稀释）代替血清进行实验。

肝匀浆的制备：用右手抓住小白鼠的尾巴，另其头朝下，然后迅速置桌上，立即用左手按住鼠的颈子右手猛拉老鼠尾巴，使颈椎卡断死亡。将肝脏取出，放在滤纸上，用天平称重，放在研钵中，生理盐水5ml研磨，然后再加生理盐水，配成1：19（即20倍稀释）的肝匀浆，用双层纱布过滤，收集滤液备用，此液每ml含G.P.T200单位。

附：试剂的配制

（1） 1M/10磷酸盐缓冲液（PH=7.4）：取磷酸二氢钾2.69g，磷酸氢二钾13.97g加水溶解后移至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，贮于冰箱中备用。

（2） 底物液（基质液）：取DL-丙氨酸1.79g，a一酮戊二酸29.2mg，先溶于约50ml磷酸缓冲液中，然后以1NNaOH校至PH=7.4，再以磷酸盐缓冲液稀释到100ml，加氯仿数滴防腐，贮存冰箱一般可用一个月（不生混浊，不生霉即可用）。

（3） 丙酮酸标准液（100ug/ml）：准确称取己干燥至衡重的丙酮酸12.64mg，置于100ml容量瓶中，以PH=7.4磷酸缓冲液稀释到刻度。此液必须临用前配制，不能存放。

（4） 2，4-二硝基苯肼液（0.02%）:称取2,4-二硝基苯肼20mg，溶于10NHCI10ml中，（或4NHCI125ml中），溶解后再加蒸馏水至100ml。