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刺龙牙根腐病诊断及防治技术规程

1范围

本文件规定了刺龙牙根腐病诊断及防治技术的术语和定义、病害诊断、病原菌鉴定、病害防治等技

术要求。

本文件适用于辽宁刺龙牙根腐病诊断及防治。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T8321.10农药合理使用准则（十）

NY/T1276农药安全使用规范准则

NY/T496肥料合理使用准则通则

GB20287农用微生物菌剂

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1刺龙牙

学名：辽东楤木（Araliaelata(Miq)Seem.)为五加科楤木属多年生落叶小乔木。

3.2刺龙牙根腐病

由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起刺龙牙腐烂的根部病害。

3.3柯赫氏法则

又称柯赫氏证病律，是用来确定侵染性病害病原物的验证程序。

4病害诊断

4.1田间诊断

病害田间症状及发病规律见附录A。

4.2室内诊断

4.2.1主要仪器

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高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、

涡旋振荡器、全温振荡培养箱、超低温冰箱等。

4.2.2主要试剂

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）、康乃馨叶片琼脂培养基（CLA）、

无水乙醇、NaClO溶液、真菌基因组DNA提取试剂盒、液氮、琼脂糖、50×TAE电泳液、DNAmaeker、

2×EsTaqMasterMix酶等。

4.2.3病原菌分离纯化

采用组织分离法进行病原菌分离。选取疑似感病植物的根组织，洗净晾干。从病健交界处切取5mm

小块，放入75%乙醇中浸泡30秒，再置于3%NaClO溶液中浸泡2分钟，后以无菌水清洗3次，在无

菌滤纸上吸干残余水分后转入培养基中培养，待长出菌丝后，切取边缘菌丝块转到新的培养基中，纯化

3次后获得纯培养物。

4.2.4病原菌培养

将分离纯化后得到的病原菌转接于PDA培养基中，25℃下黑暗培养5天，观察菌落形态及颜色。

将病原菌转接于CLA培养基中，25℃下黑暗培养20天，观察分生孢子、厚垣孢子大小及形态。

4.2.5柯赫氏法则验证

柯赫氏法则验证病原菌：

a)灭菌营养土栽培1年生刺龙牙苗，定植30天后备用；病原菌于PDA培养基上生长7天后，打

取边缘菌丝块至PDB液体培养基中，25℃、160rpm/min振荡培养5天，获得病原菌孢子液；

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b)过滤菌丝后，用血球计数板调整孢子液浓度为1×10个/mL，取50mL孢子液灌根于植株根部，

以无菌水为对照，温室培养15天后观察植株发病情况；

c)若发病症状与田间症状一致，则采集发病植株根部，再次进行病原菌分离培养，若与原病原菌

相同，则为目标病原菌。

5病原菌鉴定

5.1形态学鉴定

病原菌菌落颜色及形态，分生孢子和厚垣孢子大小及形态见附录B。

5.2分子鉴定

5.2.1病原菌基因组DNA提取

将病原菌接于PDA培养基，待菌丝长满培养基后，刮取菌丝，采用CTAB法提取病原菌基因组

DNA。

5.2.2PCR检测

以FOF1:5’-ACATACCACTTGTTGCCTCG-3’和FOR1：5’-CGCCAATCAATTTGAGGAACG-3’为

特异性引物，每20μLPCR反应体系包括10μL2×EsTaqMasterMix酶，1μL基因组DNA，正反向引

物各1μL，超纯水补充至20μL。

PCR反应程序为：95℃预变性2分钟；然后经95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，

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30个循环；最后72℃延伸2分钟。

5.2.3PCR结果判定