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载体构建
目的基因克隆
引物设计 PCR
质粒（载体）提取
质粒选择 提取步骤
质粒与目的基因双酶切
选择内切酶 摸索酶切条件（时间和温度）
电泳检测及回收纯化步骤
载体与目的基因连接
转化
感受态细胞制备 转化步骤
阳性单克隆筛选
上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养
挑菌并菌液PCR
上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。
一、原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤
1、摇菌（制作感受态细胞备用）
取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）
依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）
反应所需试剂
体积（单位：ul）
质粒
10
所需内切酶反应缓冲液
2
所需限制性内切核酸酶
1
H2O
7
将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）
4、电泳检测
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回
收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收
试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h
试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测
挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
单克隆检测
以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。
注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。
②别忘记往培养基中加AMP。
③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。
三、注意事项
三、注意事项
连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；
在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；
连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。
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