脱有机硫菌种的筛选.docx

脱 有 机 硫 菌 种 的 筛 选

固体选择培养基(BSDM):BSM加O..lmmol/LDBT乙醇溶液作为有机硫源，加

1%～2％水洗琼脂．

3.1.3DBT的投加方式

－苯井嗟吩（dibenzothiophene缩写为DBT,M=184)为晶体状物原，不溶千水（极其微溶），如研囡成粉末则成块漂浮在水而上：溶千乙醇。图3-1为DBT的分子结构式。

clibe立otlliopl论1论

图3-1DBT的分子结构式Fig.3-1Thestruc画efonnulaofDBT

3.1.3.1液体培养基中DBT的投加方式

(I)将DBT溶千乙醇中，配成DBT/乙醇溶液：

(2) 取适呈DBT/乙醇溶液加入已灭菌的液体培养基中，混匀：

(3 ) 隔夜放 置后 待用 。

3.1.3.2固体培养基中DBT的投加方式

(I)将DBT溶千乙醇中，配成DBT/乙醇溶液：

(2) 取适里DBT/乙醇溶液加入已灭菌的固体培养基中，混匀后倒平板．

(3)隔夜放置后待用。

3.2实验方法及步骤

研究中要分离的具有特殊功能的菌种在样本中并非优势菌，所以采取投其所好、取其所抗原则在营养培养基中添加硫源。通过人为方法对样本分别进行宫橾培养，使原样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，进而分离纯化得到脱硫菌株。

3.2.1样品处理

(I)分别取少许各样品加入到10.0mLBSM培养基中，浸泡过夜，千3o?c恒溫培养箱中1SOr/min培养48小时：

(2) 培养液在 IOOOr/min离心!Omin:

(3)去其底部上样，浑浊液在4800r/min离心!Omin, 去上层水相：

(4)底部的菌体以0.85％的生理盐水洗涤两次，悬浮千10.0mL的磷酸钾缓冲液

中备用。

3.2.2富集培养

（1)用移液眢移取lmL上述备用液，置千含有约1.!0mL培养基的250mL的锥形瓶中，瓶口包好纱布，作好标记．

(2)千30°C,ISOr/min条件下摇床中恒温培养：

(3)培养2d，待培养液中有混浊后，便得到增殖菌液。

3.2.3菌株的分离纯化

增殖培养得到的菌种并不是纯的目的菌种，即使在增殖培养过程中设置了许多限制因素，但其它微生物并没有完全死L,只是数鱼相对减少，一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特注的目的菌种必须进行菌种纯化即纯培养。

（1)将固体培养基千l21°C高温灭菌.10min,然后在无菌净化工作台上千无菌的条件下倾倒平板约平板的1/3~.l/3,静置至培养基澡固．

(2)将宫织培养液按10倍稀释法稀释后，将102·、10·?、10·6倍数下的稀释菌液

涂布 千平 板上进行培养 ，得到单一菌落．

(3)用接种环在无菌条件下挑取少许单一菌落千平板上划线，3o?c培养2d，观察细菌生长情况，经多次划线分离，直到得到单菌落．

(4)分离出的单菌落特征一致，并且革兰氏染色后显微观察到的菌体形态、大

小、革兰氏阴性或阳性一致，方可认为纯菌落，对纯菌落编号，作好标记，全部保藏

千4?c冰箱中。

经过分离纯化得到的大垂菌株中所需要的脱硫菌株只是少数，为了提高筛选效率，对细菌的筛选将从初筛和复筛两个方而进行实验研究。

3.2.4菌株的初筛

从上述过程中得到的纯培养物屈千通过不同途径代谢DBT的菌株。为了从这些菌中筛选出能够选择性脱除DBT中有机硫的菌株，研究中利用Gibbs分析法检测DBT降解产物来进行菌株的初步筛选。

（1)用接种针从上述平板上挑取少许单菌落，接种千含有约1.!0mL培养基的

250mL锥形瓶中，在30°C, ISOr/min 的条件下进行恒溫培养2d:

(2)用10％的Na2C0 3溶液将菌种发醇液谓pH=9.0,SOOOr/min离心!Omin除菌体，取上消4mL, 加入Gibbs试剂401止，混匀，3o?c反应30min:

(3)如果溶