DB63T1709-2018牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程.docxVIP

ICS65.020.30

B43

青海

省地

DB63

方标准

DB63/T1709—2018

牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程

2018-12-26发布

2019-03-20实施

青海省市场监督管理局发布

I

DB63/T1709—2018

前言

本标准依据GB/T1.1—2009的规则编写。

本标准由青海省农牧业标准化专业技术委员会提出并归口。

本标准起草单位：青海省畜牧兽医科学院。

本标准主要起草人：徐惊涛、孙永刚、李瑞哲。

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DB63/T1709—2018

牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程

1范围

本标准规定了牦牛胚胎快速冷冻和解冻的操作方法。

本标准适用于牦牛胚胎生产技术推广应用的规范化操作。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T5458液氮生物容器

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T25881牛胚胎

GB/T26938牛胚胎生产技术规程

NY/T1572牛胚胎移植技术规程

DB63/T1163牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

牦牛胚胎yakembryo

通过自然交配、人工授精、体外受精等方式产生的牦牛早期受精卵(受精后6d~8d)。

3.2

胚胎快速冷冻embryorapidcryopreservation

经过清洗、胚胎冷冻保护剂平衡后，将胚胎直接置入液氮中保存的一种冷冻方法。3.3

胚胎解冻thawingoffrozenembryo

将冷冻保存的胚胎按照操作程序融化，去除冷冻保护剂，使胚胎恢复活性的过程。

4试剂、耗材、设备和实验室要求

4.1试剂、耗材和设备

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DB63/T1709—2018

所用的试剂、耗材和设备以及要求见附录A。

4.2实验室要求

冷冻保存液、解冻液及移植液必须在符合GB19489相关条款的实验室中配制。4.3器具清洗、消毒

所用器具的清洗、消毒见附录B。

5试剂配制及保存

5.1试剂配制用水

试剂配制用水按照GB/T6682中的分级标准采用一级水。

5.2冷冻保存液

5.2.1基础液(BS)

TCM-199中加入20%胎牛血清(FBS)。

5.2.2平衡液(ES)

TCM-199中加入7.5%乙二醇(EG)、7.5%二甲基亚砜(DMSO)、20%胎牛血清(FBS)。

5.2.3冷冻液(VS)

TCM-199中加入15%乙二醇(EG)、15%二甲基亚砜(DMSO)、0.5mol/L蔗糖(Su)、20%胎牛血清(FBS)。

5.3胚胎解冻液

5.3.1解冻液(TS)

TCM-199中加入1.0mol/L蔗糖(Su)和20%胎牛血清(FBS)。

5.3.2稀释液(DS)

TCM-199中加入0.5mol/L蔗糖(Su)和20%胎牛血清(FBS)。

5.4改进PBS液(m-PBS)

改进PBS液(m-PBS)配制见附录C。

5.5胚胎移植液(TM)

m-PBS中加入4mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和10%胎牛血清(FBS)。

5.6解冻后胚胎培养液

TCM-199液中加入10%胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。

5.7试剂保存

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DB63/T1709—2018

5.7.1基础液、平衡液、冷冻液、解冻液、胚胎移植液等试剂在无菌操作台中配制，配制后的试剂用0.22μm滤膜过滤除菌后分别装入无菌离心管内，密封管口，在管外标注液体名称、配制日期，存入0℃~4℃冰箱或冷藏箱中保存。

5.7.2每次装、取液后，均须即时封闭试剂保存管管口。

5.7.3试剂的使用期限为7d以内。

6胚胎生产

按照GB/T26938和DB63/T1163相关技术操作规程生产。

7胚胎冷冻及解冻前准备

7.1胚胎冷冻、解冻操作室

操作室应设在牦牛胚胎采集或移植附近的场所，室内温度18℃~25℃，封闭性良好，避免阳关直射，提前清理好环境卫生，对操作台用75%酒精进行消毒。

7.2操作人员卫生安全

清洗双手并用75%酒精消毒，佩戴一次性口罩和手套，穿着消毒后的工作服，进行胚胎冷冻、解冻操作。

7.3冷冻、解冻前胚胎预备

7.3.1将采集到的牦牛胚胎及时送至操作室，置于恒温平台上