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动物细菌常见主要耐药基因检测技术
1范围
本文件规定了动物细菌常见主要耐药基因的PCR检测技术要求。
本文件适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行动物细菌四环素类、喹诺酮类、氨基糖
苷类、磺胺类及氯霉素类主要常见耐药基因的检测及gyrA、gyrB、parC和parE基因的突变分析。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
中华人民共和国农业部农医发〔2017〕25号病死及病害动物无害化处理技术规范
GB19489-2008实验室生物安全通用要求
GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求
SN/T2025-2016动物检疫实验室生物安全操作规范
SN/T3640-2013出口食品中致泻大肠杆菌检测方法PCR法
SN/T2206.12-2014化妆品微生物检验方法第12部分：绿脓杆菌PCR法。
兽医实验室生物安全技术管理规范
中华人民共和国农业部公告第302号（《兽医实验室生物安全技术管理规范》）
3术语和定义
本文没有需要界定的术语或定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）
DNase：脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）
PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）
Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）
TE缓冲液：TE缓冲液（Tris-EDTAbuffersolution）
TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisaate-EDTAbuffer）
5原理
3
根据动物细菌tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（M）、gyrA、gyrB、parC、parE、aac（6’）-Ib-cr、
aac（3）-IV、aacC4、sul1、sul2、dfrA1、cmlA和cat1等常见的主要耐药基因序列设计特异性引物，在
DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与
母链模板DNA互补的子链DNA。
6仪器和器材
6.1高速台式冷冻离心机（离心范围0～20000r/min）
6.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。
6.3PCR扩增仪
6.4电泳仪
6.5凝胶成像系统
6.6微波炉
6.7分析天平
6.8离心管：15mL离心管、1.5mL离心管和0.2mLPCR专用离心管。
6.9微量可调移液器：1000μL，200μL，100μL，50μL，20μL，10μL，2μL。
7试剂和引物
注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase
的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。
7.1DNA抽提试剂：DNAzol®Reagent，外观为淡绿色，于4～8℃保存。
7.2无水乙醇：-20℃预冷。
7.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。
7.4Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。
7.5dNTP（2.5mmol/L）。
7.6阴性对照：灭菌双蒸水。
7.7阳性对照：动物细菌耐药菌株。
7.8无菌生理盐水。
7.9TE缓冲液（pH
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