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ELISA原理、方法、操作及注意事项解析汇报人：AA2024-01-18

目录contentsELISA基本原理ELISA常用方法ELISA操作步骤ELISA注意事项ELISA在生物医学领域应用举例

01ELISA基本原理

抗原是能够刺激机体产生免疫应答并能与免疫应答产物结合的物质；抗体是机体在抗原刺激下产生的具有特异性的免疫球蛋白。抗原与抗体机体通过免疫系统识别和清除外来抗原，维持内环境稳定。免疫系统免疫学基础

特异性结合抗原与抗体结合具有高度的特异性，即一种抗体只能与相应的抗原结合。亲和力抗原与抗体结合的强度称为亲和力，高亲和力有利于形成稳定的抗原抗体复合物。可逆性抗原抗体结合是可逆的，可以通过改变条件使复合物解离。抗原抗体反应

ELISA技术原理ELISA技术中常用的固相载体有聚苯乙烯微量反应板、滤纸、硝酸纤维素膜等，其中聚苯乙烯微量反应板最为常用。固相载体将酶与抗体或抗原结合，形成酶标抗体或酶标抗原。酶标记抗体/抗原酶标抗体或酶标抗原与固相载体上的抗原或抗体结合后，加入酶的底物，酶催化底物显色，通过比色法测定光密度值，实现对抗原或抗体的定量检测。酶催化底物显色

02ELISA常用方法

原理将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的抗体，通过抗原抗体反应形成复合物，洗涤去除未结合的酶标抗体，加入底物显色。优点操作简便，特异性高。缺点灵敏度相对较低，需要较高浓度的抗原和抗体。直接法

原理先将抗原固定在固相载体上，加入特异性抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶标记的二抗与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标二抗复合物，洗涤后加入底物显色。优点灵敏度较高，可检测低浓度的抗原。缺点操作步骤相对繁琐，需要优化抗体浓度和二抗的选择。间接法

竞争法将抗原和酶标抗原同时与固相抗体竞争结合，形成抗原-抗体复合物或酶标抗原-抗体复合物。洗涤后，加入底物显色，根据显色的深浅判断待测抗原的浓度。优点可用于检测小分子抗原或半抗原，具有较高的灵敏度。缺点需要制备酶标抗原，成本较高。原理

夹心法原理先将捕获抗体固定在固相载体上，加入待测抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的检测抗体与抗原的另一表位结合，形成捕获抗体-抗原-酶标检测抗体的夹心复合物。洗涤后加入底物显色。优点灵敏度高，特异性强。缺点需要优化捕获抗体和检测抗体的浓度和比例。

03ELISA操作步骤

根据实验需求，提前准备好所需试剂，如包被液、封闭液、洗涤液、底物液等。按照试剂说明书或实验方案要求，准确配制各试剂，注意浓度、pH值等关键参数。试剂准备与配制试剂配制试剂准备

样品处理对待测样品进行适当稀释或处理，以满足实验要求。加样将处理后的样品按照实验设计加入相应孔中，注意加样量准确，避免污染。样品处理与加样

将加样后的酶标板置于恒温箱中孵育，使抗原抗体充分结合。孵育孵育结束后，用洗涤液充分洗涤酶标板，去除未结合的抗原抗体复合物。洗涤孵育与洗涤

显色加入底物液后，酶标板在恒温箱中继续孵育，使底物显色。终止在显色适当时间后，加入终止液终止反应，此时颜色不再变化。显色与终止

结果判读与分析结果判读通过酶标仪测定各孔吸光度值，记录数据。结果分析根据实验设计对数据进行统计分析，得出实验结果。注意排除非特异性结合等干扰因素。

04ELISA注意事项

保持实验室清洁，避免灰尘和污染物对实验结果的影响。温度控制在20-25℃，湿度保持在40-60%之间，以确保实验的稳定性。实验室环境使用高质量的ELISA设备，如酶标仪、洗板机等，确保实验的准确性和可重复性。定期对设备进行维护和校准，以保证其正常运行。设备要求实验室环境与设备要求

试剂选择选择高质量的ELISA试剂盒，确保试剂的特异性和灵敏度。注意试剂盒的批次和有效期，避免使用过期或质量不佳的试剂。保存条件按照试剂盒说明书的要求保存试剂，避免高温、阳光直射和冷冻。对于需要冷藏的试剂，应放置在2-8℃的冰箱中，避免反复冻融。试剂选择与保存条件

VS严格遵守ELISA实验的操作规程，包括试剂准备、样品处理、加样、孵育、洗涤、显色和终止等步骤。确保每个步骤的操作正确无误，避免误差的产生。技巧要点在加样过程中，注意避免气泡的产生，以免影响实验结果。孵育过程中要控制好时间和温度，保证反应的充分进行。洗涤时要彻底去除未结合的抗原或抗体，避免背景值的干扰。操作规范操作规范与技巧要点

影响因素样品处理不当、试剂质量不佳、操作不规范等因素都可能导致实验结果的误差。此外，实验室环境、设备状态等也会对实验结果产生影响。排除方法对于样品处理不当的问题，可以通过优化样品处理方法、增加样品稀释倍数等方式进行改进。对于试剂质量不佳的情况，可以选择更换高质量的试剂盒。对于操作不规范的问题，需要加强实验人员的培训和管理，提高操作的规范性。同时，定期对实验室环境和设备进行检查和维护，确保其符合实