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应用RNA干扰技术建立MMP-9基因沉默胃癌细胞克隆的综述报告

RNA干扰技术是一种高效的基因沉默技术，其通过特异性地降解目标mRNA分子，从而抑制该基因的表达。在胃癌研究领域中，RNA干扰技术已经被广泛应用，其中MMP-9基因沉默是研究胃癌细胞转移和侵袭的热点问题之一。本文旨在介绍RNA干扰技术在建立MMP-9基因沉默胃癌细胞克隆中的应用现状、方法流程与关键技术等。

一、RNA干扰技术概述

RNA干扰技术是通过体内或体外递送特定的RNA分子，抑制目标基因的表达。本质上，RNA干扰技术将外源RNA分子沿用了天然RNA的降解途径，将外源RNA导入到细胞内，利用RNA蛋白酶III在体内将RNA分子转化为双链RNA（dsRNA），dsRNA进入到细胞内之后，被核酸酶Dicer切割成21-23nt的小RNA，称为小干扰RNA（siRNA）。采用RNA干扰技术能够快速、便捷、有效地抑制靶点基因的表达，是分子生物学研究中常用的工具之一。

二、MMP-9基因介绍

MMP-9全称为MatrixMetalloproteinase-9，是一类具有结构特殊性和酶活性的蛋白酶。它的基因在人类基因组中位于20号染色体q11.2-q13.1，由14个外显子组成，编码一种分子量为78kDa的蛋白质。MMP-9是一种Zn2+依赖性的胶原酶蛋白酶，具有明显的基质降解作用，能够水解胶原、凝血蛋白、纤维蛋白等结构蛋白质，在调节细胞粘附、细胞迁移、肿瘤转移等生物学过程中发挥重要的作用。

三、RNA干扰技术实现MMP-9基因沉默

MMP-9基因在胃癌转移和侵袭过程中发挥了重要的作用，而RNA干扰技术可通过特异性地沉默MMP-9基因表达，来研究其生物学功能及其参与的转移和侵袭机制。

1.设计和合成siRNA

siRNA是RNA干扰技术生效的关键内容。通过合成一段siRNA序列，使其与要靶向沉默的基因的mRNA特异性杂交，从而导致目标mRNA降解，siRNA的引物设计包括杂交靶点、杂交位点、间隔序列和密码子。RNAi设计的关键是确定一条最合适的siRNA序列，通常根据目标gene的序列选择能够在接近5端的区域内识别其mRNA的siRNA序列。对于MMP-9基因而言，我们通常可以根据GenBank公布的序列，使用开放式在线工具进行siRNA提取。

2.构建RNA干扰质粒

目前的siRNA转染途径主要有两种:一种是将siRNA通过合成物的形式直接转染到细胞,另一种方法是将siRNA构建在RNA干扰质粒上。RNA干扰质粒一般是由一段酶切启动序列、RNA干扰序列和酶切终止序列等元素组成的。在制备RNA干扰质粒时，需要考虑siRNA序列的定向、长度以及GC含量等，并对其进行序列改编、克隆、扩增等一系列工作。

3.siRNA的转染

RNA干扰技术中，采用纯化的siRNA直接转染细胞，有时转染效率较低，只能实现临时性基因沉默，并不能持续很长时间，因此，siRNA转染的关键是选择高转染效率的转染试剂。经过一定的优化和筛选，可以选用某些经典的转染试剂，如LipofectamineTM、RNAiMAX、HiPerFect等。

四、RNA干扰技术在MMP-9基因沉默中的应用

RNA干扰技术广泛应用于研究不同类型的肿瘤，而MMP-9的表达和肿瘤的转移有密切的关系。Turchi等人使用RNA干扰技术探究MMP-9发挥胃癌发展及形成新的肿瘤微环境中的作用、以及细胞侵袭和迁移的机制，通过RNAi技术沉默MMP-9表达，使得细胞减少了在特异性基质中迁移和侵袭的能力,从而证实了MMP-9在细胞侵袭和迁移中发挥了重要的作用。

此外，还有一些相关研究团队通过RNA干扰技术沉默MMP-9基因，并在体内体外验证了沉默的作用，发现MMP-9基因的沉默对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等都具有显著的影响。

综上所述，虽然RNA干扰技术在MMP-9基因沉默的研究中也面临一些不可避免的问题，比如待转染的细胞、转染的药剂等需要针对不同实验情况选择最优的条件。但是由于RNA干扰技术富有可塑性和高度的特异性，使其成为沉默MMP-9基因应用最广的方法之一。在未来的研究中，RNA干扰技术还有着广阔的发展前景。