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家禽组织脏器制备单个核细胞悬液方法参考

一、准备材料

吸管(BiologixGroupLimited；3mLTransferPipets；30-0138A1)1mL移液枪及相应细胞枪头、移液管、15mL离心管及板架子、酒精喷壶、低速多用途离心机(SCILOGEX；DM0636；1804442W)PBS

(byThermoFisherScientificTM；REF：T,500mL)、红细胞裂解液(天津市激洋生物制品有限责任公司；Cat.#NH4CL2009；室温储存)、细胞冻存管(CorningIncorporrated；2.0mLCryogenicVials；REF：430659)、过滤用细胞筛(JETBIOFIL；CellStrainer；40pmNylon；CSS-010-040)

注：另一种吸管(JETBIOFIL；TransferPipets；3mL；PP-01-030)

二、脾/肝脏淋巴细胞悬浮液的制备

(一)原方案：(使用天津市激洋生物制品有限责任公司的TBD鸡外周血淋巴细胞分离液KIT；货号：LTS1090C)

.在无菌操作台中快速取脾/肝(先浸泡于加双抗的1640培养基或PBS中)用PBS在无菌平皿中清洗，器官外脂肪和包膜较多可先用镣子剥除。

.在平皿上方铺放400目金属晒网，把上述脾脏/肝脏置于晒网上。用5mL注射器吸取4mL含双抗的RPML1640培养液，往脾脏分点推注培养液，然后拔出针芯用针芯在晒网上碾碎脾脏充分，用巴氏管吸取6mL1640培养液在晒网上冲洗过滤碾碎的脾脏。

.然后转移到15mL离心管中，使用吸管反复吹打至乳糜状，再将悬液用400目细胞筛滤到50mL管（或小平皿）中，获得脾脏/肝脏单细胞悬液。

.按照PBMC分离法用PBMC分离液分离一次（因为残留红细胞较多），然后把把细胞清洗一遍，1700rpm离心5min（400xg离心8min,升降速度分别为6和7）,弃上清，留细胞沉淀。

.然后向沉淀中加入1mL红细胞裂解液，再轻轻吹打混匀，裂解4?5min后，加入10mLPBS混匀，1700rpm离心5min（400xg离心8min,升降速度分别为6和7）,弃上清。

.弃去上层液，根据细胞沉积量添加含有双抗的1640培养基（鸡完整脾脏/肝脏提取的淋巴细胞一般添加10mL含有双抗的1640培养基）或先加无血清冻存液（CELLSAVING,新赛美生物科技有限公司,NCMBiotech,Cat.No：C40100,保存于4度）-80℃冻存。

6、细胞计数：取10匹悬液，按1:1比例加入10匹稀释后0.2%台盼蓝染液，从计数板边缘缓缓滴入，染色3min后进行细胞计数。

备注：（1）常规计数方法：将计数板放在低倍镜下（10x10倍）记录大方格活细胞数。一个大格计数板容积0.1mn?。换算成每毫升细胞总数=4个大格细胞总数94x10000；（2）细胞计数仪计数法：直接取10匹细胞悬液，滴加于孔板中，把板子插入机中点开始进行计数；（3）细胞冻存液（FreezingMedium）：90%FBS+10%DMSO（二甲基亚碉dimethylsulfoxide）,每管冻存10x106个细胞，配冷存管置-80C16?18h-液氮槽长期储存。复苏时候用24孔板中每孔接5x106个细胞，添加2mLi640培养基，培养3d后观察是否有污染；

（4）红细胞过多，要用分离液分离一次；（5）脾脏和肝脏不需要用胶原蛋白酶消化。

（二）新方案：（使用天津市激洋生物制品有限责任公司的TBD鸡脏器单个核细胞分离液KIT；货号：LDS1088CP）

.在无菌操作台中快速取脾（先浸泡于加双抗的1640培养基或PBS中）用PBS在无菌平皿中清洗，器官外脂肪和包膜较多可先用镒子剥除；

.在平皿上方铺放400目金属晒网，把上述脾脏/肝脏置于晒网上。

用5mL注射器吸取4mL含双抗的PBS,往脾脏分点推PBS,然后拔出针芯用针芯在晒网上碾碎脾脏充分，用巴氏管吸取1?2mLPBS在晒网上冲洗过滤碾碎的脾脏；

.然后转移到15mL离心管中，使用吸管反复吹打至乳糜状，再将悬液用400目细胞筛滤到小平皿中，获得脾脏单细胞悬液（约5mL）；

.再取一新的15mL离心管，加入5mL鸡脏器组织单个核细胞分离液，使用塑料吸管将上一步的等体积重悬液紧贴管壁缓慢加入分离液上（一定要慢，尤其是第一滴血）。

.室温400xg（或128水平离心机1700rpm）离心15min（升降速分别为6和2）；

.离心后离心