DB13T 1721-2013辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程.docx

ICS65.020

B16

DB13

河北省地方标准

DB13/T1721—2013

辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程

TechnicalRegulationsforDetectionofPeppermildmottlevirus

2013-05-27发布

2013-06-15实施

河北省质量技术监督局发布

I

DB13/T1721—2013

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：王亚南、曹克强、王树桐、胡同乐、杨军玉、冀志蕊。

1

DB13/T1721—2013

辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程

1范围

本标准规定了辣椒轻斑驳病毒（Peppermildmottlevirus，PMMoV）的检验检测与鉴定方法。本标准适用于可能带有辣椒轻斑驳病毒的甜（辣）椒种子和苗木的检验检测工作。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1

辣椒轻斑驳病毒病

是由辣椒轻斑驳病毒危害辣椒属植物引起的一种病毒病害，在甜（辣）椒上表现为不同程度的叶片或（和）果实的变色、斑驳、畸形或坏死条斑甚至植株矮化等症状。

2.2

辣椒轻斑驳病毒

是危害辣椒属植物的一种烟草花叶病毒属（Tobamovirus）病原病毒，学名为Peppermildmottlevirus，简写PMMoV。病毒粒体直杆状，基因组为正单链RNA，由6357个核苷酸组成。

3原理

依据PMMoV具有很强的免疫原性，可采用ELISA或免疫胶体金试纸条方法进行检测；依据PMMoV基因组序列的特异性，可采用RT-PCR方法进行检测。PMMoV病原特性见附录A。

4材料、仪器、用具及药品

4.1材料

甜（辣）椒种子、叶片或果实。

4.2仪器、用具

超低温冰箱（箱内温度可达-80℃以下）；

高速冷冻台式离心机（最高转速在12000r/min以上）；

PCR仪（常规配置）；

凝胶成像系统（常规配置）；

电泳仪（常规配置）；

水平电泳槽（常规配置）；

酶标仪（常规配置）；

2

DB13/T1721—2013

各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、20μL、10μL、5μL）；

各种吸头（1000μL、200μL、20μL、10μL、5μL）；

离心管（1.5mL、0.6mL、0.2mL）；

量筒（1000mL）。

4.3主要试剂

主要试剂和缓冲液见附录C、D、E。

5调查与取样

5.1田间调查

在甜（辣）椒生长期进行调查，带有附录B记述的PMMoV为害症状的植株为疑似病株。

5.2种子取样

在11月～翌年2月份对市场销售的甜（辣）椒种子进行扦样（数量以满足检测鉴定所需为限），然后进行检测与鉴定。

5.3田间样品采集与保存

选取疑似病株上症状明显的叶片或果实（其数量以满足检测鉴定所需为限），装入聚乙烯塑料袋中密封，放入带有冰块的采集箱中带回实验室。采集袋标签应注明采集时间、地点、采集人等信息。采集的样品应放入超低温冰箱中（-80℃)保存，要尽早进行检测与鉴定。

6检测与鉴定

6.1免疫胶体金试纸条测定

将疑似病株少量发病叶片或果实预先研磨成汁液，利用免疫胶体金试纸条进行检测。具体操作见附录C。

6.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）

将样品粗提液加入已包被PMMoV抗体（市售）的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。设无病组织阴性对照、染病组织阳性对照和提取缓冲液空白对照，其中阴性对照种类和材料应尽量与检测样品一致。具体操作见附录D。

6.3反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

分别提取各样品总RNA，反转录合成cDNA，进行PCR扩增。设无病组织阴性对照、染病组织阳性对照和超纯水空白对照。具体操作见附录E。

7结果判定与记录

免疫胶体金试纸条适用于田间快速诊断，DAS-ELISA适合于样品批量检测，RT-PCR技术适用于病毒精准鉴定。在需要田间现场快速检测的情况下可选择免疫胶体金试纸条方法，检测为阳性，可判定为检出PMMoV，检测为阴性，初步判断为未检出PMMoV，若需准确鉴定，应采用RT-PCR复检；样品批量检测选

3

DB13/T1721—2013

用DAS-ELISA方法，若DAS-ELISA检测为阳性，可判定为检出PMMoV，DAS-ELISA检测为阴性，应采用RT-PCR方法复检。

完整的实验记录包括：样品来源、品种、时间、地点、方法和结果等。PCR检测需要