MTT实验方法步骤.pdf

一悬浮细胞MTT实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请

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教各位老师,不用弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!

1．介绍一种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加入1×109/L腹腔巨噬细胞

(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的MDP。收集对数生长期的UMR106

细胞，调整细胞浓度至1×108/L，加入各孔，效靶比（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。

每孔取100μl的UMR106细胞移入96孔培养板，各孔加入5g/LMTT20μl，培养4h，再加入

10％SDS100μl，测定570nm处的A值。计算公式如下：杀伤活性（％）=(1－实验组UMR106

细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)×100％

本方法参考文献，JiaoH,ShanWM,OheY,etal.AnewMTTassayfortestingmacrophage

cytotoxicitytoL1210anditsdrugresistantcelllinesinvitro.CancerImmunol

Immunother,1992;35:412～416

2．SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm

波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的

新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于

MTT法。除此之外SRB法还有以下优点：(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟

左右，而MTT加样后还需培养4小时。(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合

后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。（3）可以

测定悬浮细胞，采用16%的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT

法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。

要用MTT法，可以选用无酚红的无色培养基，离心吸取部分上清，不要吸走底部细胞和

formazan,剩下部分放烤箱烘干。就不会影响你的测定了。

二．悬浮肿瘤细胞MTT法检测细胞生长抑制率时采用的细胞裂解液配方及如何配制

1．细胞种于96孔板中，6小时左右后，加入受试药物,继续培养72小时后加入20ul5mg/ml

的MTT，37℃温育4小时，加入100ul三联液（10％SDS－5％异丙醇－12mMHCl），温育

12－20小时，用平板读数计在570nm处测定每孔的光密度值（OD值）.细胞增殖生长抑制

率和增效率分别按公式计算

2．检测悬浮细胞生长抑制率用CCK-8试剂比较好，操作比较简单，误差比较小。

三．悬浮细胞ｍｔｔ，何时加药物？细胞接种９６孔板时？

1．一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细

胞是上板同时加。

但是，我个人的经验，药物加的时机并不是固定的，具体要根据你实验本身的要检测的指标。

如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因

素。但是，如果你要检测的是其他一些指标，比如，如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，

可能就要在细胞贴壁以前就要加药了。

2．贴壁细胞一般在试验前1-2日接入９６孔板，

太晚，细胞在传代后有一个１６小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线

的底部，此时的MTT数值太低了，

太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高，

让试验时落在对数早中期最好

四．悬浮细胞如何做mtt?

1．一种方法加MTT，孵育，离心，去上清，每孔加入DMSO。振荡10分钟后选择波长，

测OD值；这种方法较麻烦，尤其是没有平板离心机的情况下。

另一种方法是酸化异丙醇法：细胞悬液离心，弃上清，加MTT，孵育，加入酸化异丙醇，

离心，取上清测OD值。后者推荐使用。

2．悬浮细胞可以用EP管离心，但是，一般悬浮细胞是养在培养板里的，如果你再把悬浮

细胞转到EP管里，再离心，会很累的。最好用平板离心机离心，如果没有，只能转到EP

管里再离了。但是，转来转去的，会丢失细胞不说，