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线虫遗传学实验报告

生75董润2007030039

同组实验者：周梦宇

实验时间：2009年10月28日—12月22日

【实验目的】

确定突变的类型（性染色体连锁、常染色体连锁或常染色体不连锁）

对突变基因进行染色体定位

确定突变基因与标记基因的遗传距离

【实验原理】

线虫的形态和生活史

秀丽线虫（C.elegance）长约1mm，直径70μm，通体透明，有雄体和雌雄同体两种性别个体。

表1线虫的形态和生活史

雌雄同体

雄体

形态特征

成虫肥大，有白斑；L3、L4幼虫腹侧即将发育为阴门的位置有半月形白斑。

瘦小，体长约为雌雄同体的2/3。其尾部的扇形交配囊可区别于雌雄同体。见图1。

染色体

2条X染色体，5对常染色体

1条X染色体，5对常染色体

生殖方式

产生精子和卵子，可以自体受精，也可以与雄性个体交配，后者优先。

只产生精子，与雌雄同体交配

后代

自体受精产生约250个子代，其中只有0.2%是雄性虫；与雄虫交配产生1000个以上的子代，其中雄虫占50%

生活史

在20℃条件下,从受精卵到成虫产卵的整个生活史约需3.5d。生长阶段分为L1-L4和成虫阶段。当条件不利时，L2幼虫可成为dauer幼虫，生存几个月，条件恢复后则蜕皮直接进入L4幼虫，可用于保种。见图2。

图1秀丽线虫雌雄同体虫和雄虫的形态结构上为雌雄同体，下为雄体。雄体的尾部扇区是其重要特征（D.PetterSnustad等，2003）。

图2秀丽线虫的生活史（LelendH等，2000）

线虫的繁育

线虫以微生物为食，实验中用大肠杆菌（OP50品系）喂养。雄性线虫的繁育是通过在同一平板饲养雄体和雌雄同体的线虫，使得后代中有50%是雄性。雌雄同体线虫的繁育是通过其自交而不断产生后代。实际操作过程中，可用灭菌后的小刀切下一小块琼脂，将其转移到新的平板上。保种的方法是使线虫在无食物，较低温（10℃）的环境下生存。

进行雄性线虫和雌雄同体交配时，一般将4-5条L4或成熟早期的雄虫，与2-3条L4或成熟早期的雌雄同体虫置于同一平板。为区别自交和雌雄交配的子代，可根据子代性状的，或只统计雄体。后者就要求在引入亲代雄虫时不能混有卵或幼虫。而且，统计子代雄体时，需将亲代雄体排除掉，这些亲代雄虫一般有3-4条，是雄虫中最衰老，体型最大的。如果需要用子代雄虫进行下一步交配，要选择L4或成熟早期的雄虫，而不能错取成亲代雄虫。如果需要子代雌雄同体进行下一步交配，要选择L4幼虫，因为成虫可能已与雄虫交配过。

操作方法

无菌操作必须在实验的全过程中进行。不可以用受到污染的培养基，若发现生长线虫的培养基被污染，需将线虫转接到干净的培养基上。

挑线虫的工具是镶在玻璃管一端的铂金丝，铂金丝尖端做成铲子状。条每条线虫之前均需要将铂金丝灼烧。使铂金丝尖端先接触菌毯，这可以沾上一些粘液，有利于挑虫。转移的过程必需快速，以免杀死线虫，同时不能划坏平板。转移线虫时还应注意不要混入其他不需要的幼虫或卵。

由于线虫会在平板上爬动，所以最可靠的计数方法是将数过的线虫移除。线虫个体可以用铂金丝挑出并烧弃。一般来说，计数是在20°C下培养4天之后进行的，因为此时所有F1代均为成虫，而较小的幼虫是再下一代。

实验一：确定突变类型（性染色体连锁、常染色体连锁或常染色体不连锁）

实验中提供了两种uncdpy双突变，可能为uncdpy在常染色体上且不连锁，uncdpy在常染色体上且连锁，或者一个突变位点在X染色体上。实验目的判断这两种双突变的类型。使两种双突变体分别与野生雄体杂交，产生F1代。若有一个突变位点位于X染色体，则F1代的雄虫均为突变个体；若两突变位点均位于常染色体上，则F1代均表现为野生性状。如果判断两突变位点均位于常染色体上，则使F1代雌雄同体自交，产生F2代。

Punc-unc-dpy-dpy-×unc+unc+dpy+dpy+

F1unc+unc-dpy+dpy-

F2若连锁，则双突变/突变1/7

若不连锁，则双突变/突变≈1/7

为操作简便，在F2代中只统计双突变个体在突变个体中的比例，利用χ2检验假设：双突变个体数/突变个体数=1/7。

实验二：对突变基因（dpy）进行染色体定位

实验材料是某种dpy突变体，需要对其突变位点进行染色体定位。实验中利用到4种unc突变体，即unc作为标记基因分别位于1、3、4、5号染色体上。所以，我们需要获得基因型为unc+unc-dpy+dpy-的雌雄同体虫，并使其自交，统计重组型个体数，判断两突变位点是否连锁。因为雄虫只有野生型，并且雌雄同体和雄虫交配才能产生子代雄虫，所以突变基因需要传给F1代雄虫，并由F1代雄虫传给F2代雌雄同体。

Punc+unc+dpy-dpy-×unc+unc