葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法 编制说明.docx

《葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法》编制说明

一、工作简况

（一）任务来源

本标准由国家标准化管理委员会于2022年立项（编号：T-469）。

（二）协作单位

本标准由中华人民共和国宁波海关负责起草，中国检验检疫科学研究院、中

科院微生物研究所、中国农科院植物保护研究所参与起草。

（三）工作过程

调研和方法研究阶段：该标准立项后，标准起草小组成员开始调研和检测方

法研究，收集了葡萄苦腐病菌（Greeneriauvicola）背景及技术方法资料。

起草阶段：2022年12月～2023年8月，完成了标准实验方面的内容。2023年8～10月，起草组根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第一单元：标准的起草

与表述规则第一部分：标准编写》的要求进行标准起草，形成征求意见稿。

征求意见阶段：2023.11月，将征求意见稿发送给农业大学、农业科学院、口岸检验检疫部门的17位专家征求意见，17位专家全部反馈意见，共计70条。对

征求到的意见进行梳理，按照意见对征求意见稿进行修改完善，形成了送审稿。

二、标准编制原则、主要内容及其确定依据

（一）编制原则

本标准规定了葡萄苦腐病菌的形态学和分子生物学检测方法。

本标准适用于葡萄果实和插条中葡萄苦腐病菌的检疫鉴定。

（二）主要内容

阳性菌株准备

葡萄苦腐病菌为田间采集和口岸截获，-80℃保存。

实时荧光PCR方法的建立

根据葡萄苦腐病菌ACT基因靶标序列，设计如下引物探针见表1，特异性检测结果如图1所示，表明，该检测方法能特异性检测葡萄苦腐病菌；灵敏度检测结果如图2所示，当葡萄苦腐病菌DNA含量在10pg时未检测到荧光信号，表明本研究所建立的TaqMan-MGB实时荧光PCR方法的最低检测限是10pg。通过对已知浓度梯度的总DNA进行实时荧光PCR检测发现，DNA含量与可检测到的荧

光信号的循环数呈负相关，即DNA含量越高，Ct值越小，3个平行试验结果显示，

标准曲线y=?3.38x+23.77（R2=0.9954）（图3）。

体系优化实验表明合适的PCR扩增反应体系为：反应总体积为20μL，0.5μL引物PAF（20μmol/L），0.5μL引物PAR（20μmol/L），0.5μL探针PAP（20μmol/L），1μL模板，RNaseFreeddH2O补足20μL。荧光PCR分子检测

方法的建立为本标准的制定奠定了良好的基础。

表1引物探针序列

名称

序列(5ˊ-3ˊ)

PAF

GCTTTCCGATGGTCGATTAGG

PAR

GCGAGAACACATACCCATGGT

PAP

FAM-CGATGCAGCTTCTATT-MGB

PA5

PA3

PA2

PA4

PA1

图1特异性试验结果

100ng

100ng

10ng

1ng

100pg

10pg

图2灵敏度试验结果

图3标准曲线结果

（三）标准确定依据

葡萄苦腐病菌的形态学特性和基因组特征是该病菌检疫鉴定的依据。根据葡萄苦腐病菌分离物的培养特征，对植物样品进行分离培养，观察其形态特征；依据葡萄苦腐病菌的基因组特征建立实时荧光PCR检测方法；通过这些方法的有效

组合，判断样品是否带有葡萄苦腐病菌。

三、试验验证的分析、技术经济论证以及预期效益

综述报告：葡萄苦腐病菌属于真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），粪壳菌纲（Sordariomycetes），间座壳目（Diaporthales），Melanconiellaceae，盘梭孢属（Greeneria），分布于美国、乌拉圭、澳大利亚、新西兰、巴西、南非、希腊、意大利、印度、日本、中国台湾、江西有局部发生。2017年宁波口岸全国首次从台湾葡萄上截获葡萄苦腐病菌。葡萄是世界四大水果之一，具有适应性强、结果早、效益高的特点。由于其经济价值较高，我国近年来葡萄产业发展十分迅速，包括台湾省在内的全国34个省(市、自治区)都有种植。葡萄栽培和加工已成为发展地方经济、增加农民收入的主要途径。葡萄苦腐病菌可侵染葡萄的根茎部、枝叶和果实，甚至葡萄花序，对鲜食和酒用葡萄均有严重影响。造成产量降低，质量下降。葡萄苦腐病在北卡罗来纳州造成产量降低30%，在一些严重发生地区产量损失高达50%。考虑到葡萄苦腐病菌的高度危害性，有必要开展该病菌的检测鉴定技术研究工作，并使之成为标准化的操作程序