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赣南师范学院生命与环境科学学院

毕业论文实验方案

论文题目：滤纸糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究

学生姓名：刘淼

学号:100907025

指导老师：卢占军博士

起止时间：2013年3月—6月

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实验原理：利用蛋白质分离纯化方法，从枯草芽孢杆菌中分离出纤维素酶，将其分别作用于

羧甲基纤维素(CMC）和滤纸，其生成的还原性糖能和3。5——二硝基水杨酸（DNS）反应

生成棕红色物质,利用分光光度法测出纤维素酶的活性强度。

纤维素酶

+

滤纸糖纤维二糖、葡萄糖等还原性糖DNS棕红色物质

药品材料:氢氧化钠、葡萄糖、3.5—-二硝基水杨酸（DNS）、硝酸、冰醋酸、醋酸钠、酒石

酸、滤纸、纤维素酶制剂；

仪器:分光光度计、恒温水浴锅、干燥箱、分析天平；

实验设计：

一、实验前期准备工作:

1、醋酸-醋酸钠缓冲液的配制：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml,制成0.1mol/L醋酸溶液.称

取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0。1mol/L醋酸钠溶液。使用时以4:6的比例混

合，低温冷藏备用。

2、葡萄糖溶液的配制：将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重,准确称取100mg于

100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL,充

分混匀。

3、3.5—-二硝基水杨酸的配制：准确称取DNS6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶

解后,加入2mol/LNaOH溶液262mL,再加到500mL含有185g酒石酸钾钠

(C4H4O6KNa·4H2O,MW=282。22)的热水溶液中，再加5g结晶酚(C6H5OH，MW=94.11）

和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126。04），搅拌溶解，冷却后移入1000mL容量瓶中

用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。

4、葡萄糖标准曲线的绘制：取8支洗净烘干的25mL具塞刻度试管，编号后依次加入0ml

0.2ml0。4ml0.6ml0。8ml1.0ml1。2ml1。4ml葡萄糖标准溶液，然后用蒸馏水分别定容至

2.0ml。配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后,向各试管中加入1.5mLDNS溶液，

摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25mL,充分混匀。在540nm波长下，以1号

试管溶液作为空白对照,调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量

（mg)为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标,在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。

二、滤纸对实验的影响分析：由于滤纸中也含有一定量的还原性糖，所以试验中应该排除底

物对实验的影响。称取等量碾碎的滤纸与DNS充分反应，测其OD值。

三、酶促反应时间的研究：酶的反应时间不同，其产物浓度也不一样.依次取反应时间为0min

2min4min6min8min10min12min14min的反应体系,加入DNS充分显色测其OD值.

四、DNS试剂量的确定：DNS本身也具有一定的颜色，如果过量也会对实验结果造成影响，

所以应该设计实验确定DNS的加入量。取相同酶反应体系，分别加入0。3ml0。6ml0。9ml

1.2ml1。5ml1。8ml2。1ml2.4ml显色剂DNS充分显色，测其OD值。

五、吸收波长的确定：取450nm—590nm波长段，以每20nm一个区段，分别测其OD值，

绘图分析结果。

六、沸水浴显色时间的确定：取相同酶反应体系，DNS沸水显色分别