植物基因工程.ppt

4、共整合质粒（1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌pBR322质粒带上一段与Ti质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；（2）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目的基因两端带上了与Ti质粒T-DNA同源的DNA序列；（3）然后再将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的农杆菌中。（4）引入的衍生质粒和原细胞中Ti质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，称共整合质粒。第96页,共117页，2024年2月25日，星期天3、双元载体“双元载体”，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。含有为T-DNA转移所必须的Vir区的质粒，另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。Binaryvectorsystem,characterisedbythesplittingoftheTi-plasmidintotwo(Ti-plasmidandT-DNAvector).ThesizeofthethreeDNApiecesisnotdrawntoscale.第97页,共117页，2024年2月25日，星期天第98页,共117页，2024年2月25日，星期天第99页,共117页，2024年2月25日，星期天第五节植物基因转化方法

第100页,共117页，2024年2月25日，星期天农杆菌介导法基因枪法植物转基因技术花粉管通道法其它方法优点：低成本易操作、转基因的低拷贝数低、导入片段的确定性好。缺点：受作物基因型的影响较大优点：低成本易操作、不受基因型影响、不需要经过组织培养可以获得转基因种子。缺点：导入片段的确定性差、转化效率很低。优点：不受作物基因型的限制。缺点：成本高、转基因的拷贝数高、导入片断的确定性差聚乙二醇法、显微注射法、激光介导法、脂质体介导法第101页,共117页，2024年2月25日，星期天?①农杆菌介导转化基因：农杆菌的Ti质粒可以作为载体。Ti质粒上有两个区域，一个是TDNA区，这是能够转移并整合进植物受体的区段；另一个是Vir区，它编码实现质粒转移所需的蛋白质。将待转化的外源基因先克隆在大肠杆菌质粒上，然后将此质粒转入不会引起冠瘿的农杆菌(这种菌的Ti质粒已除去了TDNA)，使外源基因通过同源重组整合在Ti质粒上；然后用带有外源基因的这种农杆菌去转化植物细胞，将外源基因转入植物细胞的基因组。

第102页,共117页，2024年2月25日，星期天第103页,共117页，2024年2月25日，星期天?②直接转入基因：这是将裸露的DNA直接导入植物细胞，然后将这些细胞在体外培养再生出植株。裸露的DNA的转化效率较低，因而要辅之以高效率的组织培养系统。??

???植物细胞有一层很厚的细胞壁，因此需先去除植物细胞壁，使之成为原生质体，然后用来直接转入外源DNA。当然，也可用机械的方法将DNA直接注入植物细胞而毋须去除细胞壁，这类方法有用显微操纵仪把DNA直接注入植物细胞，也可在金属微粒上蘸涂了外源DNA，把它当作子弹，用“基因枪”轰击植物组织而进入植物细胞。??

??第104页,共117页，2024年2月25日，星期天第105页,共117页，2024年2月25日，星期天第106页,共117页，2024年2月25日，星期天Cassavaplantletproducedthroughmicropropogation.第107页,共117页，2024年2月25日，星期天电击法将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物。第108页,共117页，2024年2月25日，星期天③原生质体融合：将不同物种的原生质体进行融合，可实现两种基因组的结合。也可将一种细胞的细胞器，如线粒体或叶绿体与另一种细胞融合，此时，是一种细胞的细胞核处于两种细胞来源的细胞质中，这就形成了胞质杂种(cybrid)。

第109页,共117页，2024年2月25日，星期天4.花粉管通道法微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房;柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上;花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后