ELISA实验 Protocol_原创精品文档.pdfVIP

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测

定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或

抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与

液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应

而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈

一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，

产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进

行定性或定量分析。

所需试剂和耗材：

1.抗原或抗体溶液。

2.酶标记的抗原或抗体溶液。

3.洗涤液。

4.底物溶液。

5.终止液。

实验仪器：

1.酶标板。

2.移液器。

3.洗涤器。

4.分光光度计。

1.准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存

和使用。

2.确保实验区域干净整洁，并无菌操作。

3.了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。

实验方法（以双抗夹心法为例）：

1.在酶标板的每个孔中加入100ul的标准品或待测样本，然后在37℃

的环境中孵育2小时。

2.用洗涤液洗涤3次，每次5分钟，以确保去除未结合的物质。

3.加入生物素化抗体工作液，在37℃的环境中孵育1小时，然后再次

用洗涤液洗涤3次。

4.加入链霉亲和素-HRP工作液，在37℃的环境中孵育0.5小时，再用

洗涤液洗涤3次。

5.加入底物溶液，在37℃的环境中孵育15-20分钟，注意避光。

6.加入终止液，5分钟内检测450nm波长的OD值，并记录数据。

7.使用分光光度计进行定量分析，根据标准品和待测样本的OD值计

算出相应的浓度或含量。

注意事项：

1.在实验过程中，要注意防止污染，尤其是避免交叉污染，因为这会

对实验结果产生极大的影响。

离心处理。

3.在孵育和洗涤过程中，要保证温度和时间的一致性，这有助于提高

实验的准确性。

4.在加入底物溶液和终止液时，要保证速度和量的准确性，这有助于

保证实验结果的可靠性。

5.在使用酶标板时，要保证其干净整洁，并且要正确地加样和读数，

这有助于提高实验的准确性。

6.在实验结束后，应该将实验区域和仪器进行彻底的清洗和消毒处

理，以防止污染和交叉污染的发生。

7.在分析数据时，应该注意数据的正确性和可靠性，并且要进行合理

的统计和分析，以保证实验结果的准确性。

常见问题及解决方法：

1.实验结果不稳定：这可能是由于操作不当或者试剂质量不稳定引起

的。解决方法是严格按照操作步骤进行实验，并使用质量可靠的试

剂。同时也要注意避免孵育和洗涤过程中温度和时间的不一致性。

2.实验结果误差较大：这可能是由于标准品或待测样本中存在干扰物

质或者实验操作不当引起的。解决方法是使用高质量的标准品和待

测样本，并进行预处理以去除可能的干扰物质。同时也要注意洗涤

液的使用量和加入时间，以及底物溶液和终止液的加入量和加入时

间等因素。

的。解决方法是使用准确的读数设备和分析软件，并根据标准品和

待测样本的实际OD值进行计算和处理数据，以保证实验结果的准

确性。