生物化学--实验三血清总蛋白的测定.pdfVIP

实验三血清总蛋白的测定

及其计量反应曲线的制作

【目的要求】

1.双缩脲法测定蛋白质含量的实验原理、关键技术和特点意义。

2.熟悉双缩脲法测定蛋白质的剂量反应曲线的制作方法与原则*

3.熟悉721分光光度计的使用和常规维护

【实验原理】

两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（HN-OC-NH-CO-NH），因分子内含有两个邻

22

接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应[A]，生成紫红色络合物。

NH

2

O=CNHNH2NH2

NH2135～190℃O=C2Cu2+O=CC=O

+△NHOHNHHN

NH2O=CˉO=CCu2+C=O

ˉ

O=C

NH↑NHNHHN

NH3222

2

尿素双缩脲紫红色络合物

［A］

蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生

双缩脲反应[B]，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10~120g/L

范围内有良好的线性关系。

OCOCCO

NHNHHN

RCHCu2+RCHHCR

Cu2+

OCOHˉ

NHOCCO

NHHN

RCH

RCHHCR

蛋白质等含肽键化合物紫红色络合物

［B］

据此，对已知系列浓度的蛋白标准液（S1~S5）做双缩脲反应，用其浓度作横坐标，吸

光度为纵坐标，即可绘出一条过原点的蛋白质双缩脲反应剂量曲线。通过此曲线，便可查

出测定管的蛋白质浓度，进而求算出标本的总蛋白浓度。亦可通过测定管吸光度、任一标

准管的吸光度和该标准管的蛋白质浓度，算出标本中的总蛋白浓度。

【实验准备】

一、器材

1.试管及试管架

2.0.2ml微量吸管或200μl微量加液器

3.1ml、2ml、5ml刻度吸管

4.721型分光光度计

5.坐标纸及绘图工具