重组体的筛选与鉴定【优秀完整版】.pptVIP

重组体的筛选与鉴定;第六章重组体克隆的筛选和鉴定;转化子和重组子;选择(selection)筛选(screening)

选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。

筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程

由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法。;根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。

有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。

;转化率的影像因素;遗传学选择法（geneticselection）：主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型变化直接选择重组体的方法。

抗药性、显色、营养缺陷等;一、抗药性标记及其插入失活选择法;pBR322;（1）四环素：;3.选择过程：;当使用pUC系列载体时，白色菌落一般都是重组体；

或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。

筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携带有外源插入片段的重组体挑选出来

（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。

与一抗的特异性结合。

mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。

最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）

TK+细胞能产生胸苷酸激酶，???以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。

抑制细菌生长，但不杀死细菌。

出同源异型盒基因定点突变的ES细胞克隆，并得到含该突变的嵌合体小鼠

重组子：含有重组DNA分子的转化子成为重组子。

从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。

专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。;（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程;二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法;假阳性：

如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终止密码；（不破坏?肽）。;;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。;小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;二、酶切电泳筛选法;;;;不同克隆的酶切结果;筛选过程;用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并进行克隆,在前者的克隆中筛选到A基因,但在后者的克隆中未筛选到A基因,请说明原因.

;三、PCR扩增检测法;1.核酸杂交;二、核酸杂交检测方法;;Southernblot筛选结果;（1）原位杂交筛选;;（2）R-环检测法;;2.Northernblotting;第五节免疫化学检测法;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;;2.放射性抗体检测法过程;3.Broome-Gilbert双位点检测法;;二、免疫沉淀检测法;2.优缺点;;三、酶联免疫吸附测定（ELISA）;;2.ELISA检测的一般步骤;加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。;加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。;加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。;;在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。;的局限性;临床检验常用的单抗;四、免疫印迹（westernblotting）法;②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：;;③蛋白质电泳的分子量标准;;④凝胶中的蛋白质染色：;直接染色电泳结果;（2）Westernblotting;Western装置;②Blotting;;1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与

膜上的蛋白结合。;④结果;转译筛选法有两种:

杂交选择转译（hybridselectedtranslation,HART)

杂交抑制转译(hybridarreatedtranslation,HRT)。