课题3____血红蛋白的提取和分离.ppt

分离血红蛋白溶液装配好的凝胶柱四、纯度鉴定使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。*学习目标理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理了解缓冲液的组成及其作用血红蛋白的分离－－样品处理蛋白质的分离的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、凝胶色谱法（分配色谱法）1、凝胶：是由多糖类化合物分子（如葡聚糖或琼脂糖）在一定的条件下互相交联在一起构成的多孔小球体（凝胶粒），内部有许多贯穿的通道。2、原理（依据：蛋白质分子量的大小）当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，①相对分子量较小的蛋白质容易进入（扩散作用）凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示

二、缓冲溶液：1、作用：能够抵制外界的酸或碱对溶液的PH的影响，维持PH基本不变。2、实验中目的：利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。3、本实验缓冲液：磷酸缓冲液三、电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。（向着与其所带电荷相反的电极移动）2、原理：各种分子的带电性质、分子本身的大小、形状的不同，迁移速度不同，从而分离。3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳电泳分离结果测定蛋白质相对分子质量通常用：SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳有何作用？使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定一、样品处理血液血浆血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）90％思考：用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。一、样品处理1、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放3、分离血红蛋白溶液目的：去除杂蛋白步骤：采集血样，低速短时间离心，吸取血浆，盐水洗涤（重复三次）蒸馏水、甲苯、磁力搅拌器作用分别是？有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色固体）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）二、粗分离——透析a过程：b目的：c原理：除去样品中分子量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。三、纯化---凝胶色谱操作:1、凝胶色谱柱的制作：2、凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。50cm高3、样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。