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LIF基因慢病毒载体构建及其在人脂肪间充质干细胞的表达

汇报人：

2024-01-18

目录

contents

引言

LIF基因慢病毒载体构建

人脂肪间充质干细胞培养与转染

LIF基因在人脂肪间充质干细胞中表达分析

结果讨论与意义分析

参考文献

引言

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慢病毒载体能够高效地将外源基因整合到宿主细胞基因组中，实现长期稳定的基因表达，是研究基因功能和细胞治疗的重要手段。

慢病毒载体优势

AMSCs具有多向分化潜能和免疫调节功能，在再生医学和细胞治疗领域具有广阔应用前景。

脂肪间充质干细胞（AMSCs）治疗潜力

白血病抑制因子（LIF）是一种多功能细胞因子，对AMSCs的增殖、分化和迁移具有重要调节作用。

LIF基因对AMSCs的重要性

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近年来，LIF基因在干细胞生物学和再生医学领域的研究日益增多，但其在AMSCs中的具体作用机制尚不完全清楚。

LIF基因研究现状

慢病毒载体已被广泛应用于基因功能研究、基因治疗和细胞治疗等领域，其安全性和有效性得到了广泛认可。

慢病毒载体应用现状

随着基因编辑技术和细胞治疗技术的不断发展，慢病毒载体将在未来实现更加精准、高效的基因治疗和细胞治疗。

发展趋势

分析LIF基因表达对hAMSCs增殖、分化和迁移等生物学特性的影响。

将构建的慢病毒载体转染至hAMSCs中，检测LIF基因的表达情况。

构建携带LIF基因的慢病毒载体。

研究目的：本研究旨在构建携带LIF基因的慢病毒载体，并探讨其在人脂肪间充质干细胞（hAMSCs）中的表达及对hAMSCs生物学特性的影响。

研究内容

LIF基因慢病毒载体构建

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慢病毒载体定义

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，具有高效、稳定、安全等特点。

慢病毒载体优点

能够感染分裂和非分裂细胞，实现长期稳定的基因表达；具有较低的免疫原性，能够减少免疫反应。

LIF基因获取

从人基因组或cDNA文库中获取LIF基因序列，设计特异性引物进行PCR扩增。

克隆载体选择

选择合适的克隆载体，如pUC系列或pBluescript系列，将LIF基因插入到克隆载体中。

重组质粒鉴定

通过酶切、PCR和测序等方法对重组质粒进行鉴定，确保LIF基因正确插入到克隆载体中。

包装质粒共转染

将含有LIF基因的慢病毒骨架质粒与包装质粒共转染到293T细胞中，收集病毒上清液并进行浓缩纯化。

病毒滴度测定

通过感染细胞并计数荧光细胞的方法测定病毒滴度，以评估慢病毒载体的表达效率。

慢病毒骨架质粒

选择合适的慢病毒骨架质粒，如pLVX或pWPXL等，将LIF基因从克隆载体中切下并插入到慢病毒骨架质粒中。

复制能力检测

通过体外实验检测慢病毒载体的复制能力，确保其不具有自我复制的能力。

毒性评估

在细胞水平和动物模型中评估慢病毒载体的毒性，包括细胞毒性、基因毒性等。

免疫原性评估

评估慢病毒载体的免疫原性，以减少免疫反应对基因治疗的影响。

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01

人脂肪间充质干细胞培养与转染

03

干细胞来源

从人脂肪组织中分离得到间充质干细胞。

培养条件

使用含有特定生长因子的培养基，在37°C、5%CO2的培养箱中进行培养。

鉴定方法

通过流式细胞术鉴定表面标志物，如CD73、CD90和CD105等，以确认干细胞的纯度。

荧光显微镜观察

在荧光显微镜下观察转染后细胞的荧光表达情况，初步判断转染效率。

qPCR检测

通过qPCR方法检测目的基因在转染细胞中的表达水平，进一步确认转染效率。

功能性实验验证

进行相关的功能性实验，如细胞增殖、分化等，以验证目的基因在转染细胞中的功能。

LIF基因在人脂肪间充质干细胞中表达分析

04

使用Trizol等试剂提取细胞中的总RNA，为后续RT-PCR实验提供模板。

提取人脂肪间充质干细胞总RNA

以提取的总RNA为模板，利用反转录酶和特异性引物合成cDNA。

反转录合成cDNA

以cDNA为模板，使用特异性引物对LIF基因进行PCR扩增。

RT-PCR扩增目的基因

通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测和分析，确定LIF基因在mRNA水平的表达情况。

结果分析

01

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提取人脂肪间充质干细胞…

使用RIPA裂解液等试剂提取细胞中的总蛋白。

SDS电泳分…

将提取的总蛋白进行SDS电泳，分离不同分子量的蛋白。

转膜与封闭

将电泳分离后的蛋白转移到PVDF膜上，并用封闭液封闭非特异性结合位点。

一抗与二抗孵育

使用特异性一抗与LIF蛋白结合，再使用二抗与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。

显色与结果分析

使用ECL发光液等试剂对抗原-抗体复合物进行显色，通过成像系统获取结果，并分析LIF蛋白的表达情况。

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05

通过CCK-8等细胞增殖实验方法，检测LIF基因表达对人脂肪间充质干细胞增殖能力的影响。

细胞