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美洲黑杨性别苗期鉴定技术规程-SSR分子标记法

1范围

本文件确立了利用SSR分子标记对美洲黑杨进行苗期鉴定的程序。

本文件适用于以美洲黑杨（Populusdeltoides）苗期幼嫩组织（叶片、芽等）为材料，利用SSR分

子标记对美洲黑杨性别苗期进行分子鉴定的原理、主要仪器、试剂、操作程序和鉴定结论。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

分子标记molecularmarkers

指以直接检测DNA核苷酸序列的差异为基础的遗传标记。

性别鉴定sexidentification

对雌雄异株植物利用与性状关联的特异性状或通过分子标记技术鉴定性染色体确定植株性别。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件

SSR：简单重复序列标记（SimpleSequenceRepeats）

注：是基因组中由2个～6个核苷酸组成的DNA串联重复序列。

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）

bp：碱基对（basepair）

CTAB:十六烷基三甲基溴化铵（CetylTriethylAmmoniumBromide）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

PVP：聚乙烯吡咯烷酮K30（Polyvinyl-pyrrolidone）

EDTA：乙二胺四乙酸（Eyhylenediamine-tetraaceticacid）

Tris：三羟甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane）

TEMED：四甲基乙二胺（Tetramethylethylenediamine）

5原理

美洲黑杨属雌雄异株植物，为XY性别决定型，其性别二态性主要体现在花器官差异。在达到性成熟

后，雌性花器官授粉产生大量包裹种子的飞絮，造成了严重的环境污染；雄株则不产生飞絮。美洲黑杨

的幼苗期一般是5-7年，无法在性成熟前通过外观直接鉴定性别。通过标准起草人团队对美洲黑杨性别

决定机制多年研究积累，发现美洲黑杨的性别是由位于性染色体Y（即19号染色体）末端的一段42Kbp特

异序列决定，在性染色体X单倍型上不存在该等位区段。在美洲黑杨性别决定基因所在的Y单倍型42Kb区

间内开发通用SSR引物（NJFU582、NJFU600和NJFU602），可以利用PCR扩增片段的有无鉴定植株性别。

3

依据本文件对美洲黑杨性别鉴定时，以本文件公布的SSR引物进行PCR扩增，通过琼脂糖电泳或聚丙

烯胺凝胶电泳等技术检测扩增产物，若待测样品检测到扩增产物，即为雄株；若未检测到扩增产物，则

为雌株。

6检测方案

通则

对于性别鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的精准度可能有所不同。应统筹考虑

检测规模和检测能力，选定适宜的检测平台、样品状况，制订相应的检测方案。

在严格控制条件下，合成性别鉴定引物，按照确定的鉴定平台对样品按DNA提取、PCR扩增、电泳和

结果判定的程序进行检测。

DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照检测

平台的要求，允许对本标准的规定作适当调整。

检测平台

6.2.1性别鉴定可采用聚丙烯胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳检测，在同一电泳板上比较试验样品。

6.2.2对于待测样品数量较多，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增

仪、DNA分析仪进行组合，提高检测综合效率。

引物

参照本标准附录A中的三对引物序列进行合成，建议纯化方式以PAGE或HPLC。

样品

选择苗期植株幼嫩根、幼嫩茎、幼嫩叶等1.0g~5.0g组织，经液氮冷冻后，放置在超低温冰箱保

存，检测备用。

检测条件

美洲黑杨性别鉴定应在有利于检测实施的控制条件下进行，包含但不限于下列条件：

a）鉴定员熟悉所使用检测技术的知识和技能；

b）所有仪器与使用的技术相匹配，并已经过定期维护、验证