猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定.pdfVIP

猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定

、实验目的

1、掌握等电点沉淀、盐析及离子交换层析原理及操作。

2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程。

3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

二、实验原理

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激

酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断

开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

猪胰蛋白酶的分子量约为23400,其等电点约为pH10.8,最适pH7.6〜8.0,胰

蛋白酶在pH3条件下较稳定，在pH5以上易自溶，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用,

在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。

本实验以猪胰脏为材料，首先用酸性水溶液抽提组织，在Ca2+离子存在条

件下，以少量胰蛋白酶结晶激活所得的酶原，再以硫酸铵盐析获得粗胰蛋白酶。经

过透析除盐，以羧甲基纤维素柱阳离子交换层析进行纯化，即可获得较纯的胰蛋

白酶。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基

与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和

羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋

白酶对这些键的敏感性次序为：酯键酰胺键肽键。因此可利用含有这些键的酰

胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。本实验以酪蛋白为底物的方法来

测定胰蛋白酶活力，其主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解

精品资料

底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的

水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标

准酪氨酸溶液的光吸收值做对照，根据酶活力蛋白的定义，确定样品中胰蛋白酶的

活性。活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1m酪

氨酸在280nm处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。

三、试剂和器材

1、试剂：

（1）pH2.5乙酸酸化水：在酸度计监测下，向蒸馏水中加入乙酸，使pH达

2.5。

（2）10%（V/V）HAc溶液

（3）2.5mol/LHSO

24

（4）5mol/LNaOH

（5）2mol/LHCl

（6）0.001mol/LHCl

（7）0.01mol/L,pH5.0，柠檬酸钠缓冲液：

量取41mL0.01mol/L柠檬酸溶液（2.10gHCHOHO/L）,

36572

加入59mL0.01mol/L柠檬酸钠溶液（2.9gNaCHO2HO/L）混匀，

36572

用酸度计检查pH值是否为5.0。

（8）0.05mol/L,pH5.0，柠檬酸钠缓冲液：

量取8.2mL0.05mol/L柠檬酸溶液（10.5gHCHOHO/L）,

36572

加入11.8mL0.05mol/L柠檬酸钠溶液（14.705gNaCHO2HO/L）

3