PCR常见问题分析及对策.docx

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)

问题1：无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无原因:

1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适

引物设计不当或者发生降解

反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:

1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度

重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

降低退火温度、延长延伸时间

问题2：非特异性扩增

现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

原因：

引物特异性差

模板或引物浓度过高

酶量过多

Mg2+浓度偏高

退火温度偏低

循环次数过多对策：

重新设计引物或者使用巢式PCR

适当降低模板或引物浓度

适当减少酶量

降低镁离子浓度

适当提高退火温度或使用二阶段温度法

减少循环次数问题3：拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：

1.模板不纯

1.模板不纯

2.Buffer不合适

3.退火温度偏低

3.退火温度偏低

酶量过多

dNTP、Mg2+浓度偏高

6.循环次数过多

6.循环次数过多

对策：

1.纯化模板2.更换Buffer

适当提高退火温度

适量用酶

适当降低dNTP和镁离子的浓度

减少循环次数问题4：假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物原因：

靶序列或扩增产物的交*污染

对策：

操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管

及加样枪头等均应一次性使用。

各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区

引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4

（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不

超过9）的引