pcr反应步骤及注意事项 .pdfVIP

实验中的一些好习惯

1加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均

2移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性

3一定要记着关水浴箱，切记切记

4多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了

5所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因

6所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存备用，

以减少重复加样次数，避免污染机会。

7PCR试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

试验前准备，防止RNA酶污染的措施：

1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。

2.DEPC处理

（1）0.1%DEPC水：100ml超纯水加入0.1mlDEPC，充分混匀，高压灭菌。

（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μ、l20μlTip

头；EP管和PCR反应管等）；用0.1%的DEPC水（1000ml超纯水加入1mlDEPC）37℃浸泡过夜，高压

灭菌。

枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%的DEPC水，再灭菌就行了。

3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，

然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能

高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

6．试剂尽量分装，不要原瓶多次取用。

7.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

8.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

标本处理区，包括扩增摸板的制备；

PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；

产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→

产物处理。

切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区，PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个

区；

使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶

的污染。

1引物的设计、合成

应用Permier5.0软件，参照GenBank中注册的Mass41株IBV全基因序列(GeneBank索引号：gi

︱gb︱AY851295.l︱)中N基因序列及3’端非编码区(UTR)序列，设计了一对引物NP1和NP2，其引物扩增产物

包括全部N基因以及IBV基因组3’端非编码区(UTR)的基因片断，跨幅为1404bp。引物由北京赛百盛生物公司

合成，序列见表:

NP15’CCAGGGGAAAACTTGTGAGGA3’

NP25AAATCTAAGGGTCTACCGTTCGTT3’

注意：

（1）引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模

板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最

好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否