实验教学夜大扩.pptx

单向扩散与双向扩散SingleimmunodiffusionDoubleimmunodiffusion小组成员：宁妙然林威王思欧顾笑岩于飞袁丽佳指导老师：郭晓欢

2008-12-18第一实验室实验原理实验步骤结果分析参考文献单向扩散与双向扩散

2008-12-18第一实验室单向扩散与双向扩散——实验原理单向扩散在含有特异抗体的琼脂板上打孔，加入定量抗原，其在琼脂中扩散时与抗体结合形成沉淀环，直径与抗原浓度正相关。抗原抗体特异性结合形成沉淀双向扩散可溶性抗原和相应抗体在琼脂中相互扩散形成一定类型沉淀线。抗原抗体存在多种系统时可呈现多条沉淀线以至交叉反应。

2008-12-18第一实验室单向扩散与双向扩散——实验步骤单向扩散琼脂的配制1稀释抗体2制板打孔加样3保存4观察测量结果5

2008-12-18第一实验室单向扩散——实验步骤琼脂的配制1称取1g琼脂粉末溶于50ml生理盐水，95℃恒温箱中充分溶解，使琼脂充分均一化。

2008-12-18第一实验室单向扩散——实验步骤稀释抗体2用pH7.2的PBS稀释标准抗人IgG抗体，按1：70稀释，并分装试管（2ml/管）。

2008-12-18第一实验室单向扩散——实验步骤将已经稀释的抗体在水浴中预热0.5min，倾注于已溶化的2%盐水琼脂管中，混匀后迅速倾注于玻片上，静置凝固。制板打孔加样——制板3

2008-12-18第一实验室单向扩散——实验步骤将琼脂板置于模板之上，用打孔器打孔。制板打孔加样——打孔3

2008-12-18第一实验室单向扩散——实验步骤制板打孔加样——加样3用微量加样器向孔中加入已经稀释的不同浓度的待测人血清和生理盐水对照，每孔10μl。生理盐水对照50倍稀释血清40倍稀释血清30倍稀释血清

2008-12-18第一实验室单向扩散与——实验步骤保存4放入湿盒中，37℃温箱保存24h。

2008-12-18第一实验室单向扩散——实验步骤观察结果5 取出琼脂板，测量各孔沉淀环直径，根据标准曲线测出标本中所含IgG含量，将全班实验结果做出统计及均值。

2008-12-18第一实验室单向扩散与双向扩散——实验步骤双向扩散琼脂的配制1稀释抗体2制板打孔加样3保存4观察测量结果5

2008-12-18第一实验室双向扩散——实验步骤琼脂的配制1称取0.5g琼脂粉末溶于50ml生理盐水，95℃恒温箱中充分溶解，使琼脂充分均一化。

2008-12-18第一实验室双向扩散——实验步骤将1%盐水琼脂从水浴中取出,稍冷却后,迅速倾注于玻片上，静置凝固。打孔方法相同。制板打孔加样——制板打孔3

2008-12-18第一实验室双向扩散——实验步骤制板打孔加样——加样3用微量加样器向孔中加入1~6号抗原和抗体，每孔10μl。抗体1~6号抗原

2008-12-18第一实验室双向扩散——实验步骤保存4放入湿盒中，37℃温箱保存24h。

2008-12-18第一实验室双向扩散——实验步骤观察结果5 根据沉淀线判断抗原同一性。123

2008-12-18第一实验室双向扩散——实验步骤观察结果5 两沉淀线独自形成并交叉，说明两孔中抗原完全不同，为非同一性反应。2融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。1融合性沉淀弧出现支线，说明两孔中抗原有相同部分，又有不同部分，为部分同一性反应。3

2008-12-18第一实验室单向扩散——结果分析误差舍去6.5mm值，对各组数据进行降序排列，再取平均值代入标准曲线计算准备室稀释血清时标签混淆微量加样器取样量误差较大在湿盒中t24h琼脂裂隙加样顺序颠倒

2008-12-18第一实验室单向扩散——结果分析1．抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而且还应注意存放的方法，防止效价下降。2．标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长期应用。3．测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。4．有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率、但抗原性相同的两个组分。例如α重链病血清中出现的α重链和正常IgA发生反应，就形成内外两重环。5．在单向扩散试验时，有时会出现结果与真实含量不符，这主要出现在Ig测定中。如用单向克隆抗体或用骨髓抗原免疫动物获得的抗血清，都存在结合价单一的现象，若用此作为单向扩散试剂测量正常人的多态性抗原，则抗体相对过剩，使沉淀圈直径变小，测量值降低。6．测得结果的假阳性升高现象与上面相反，如用多克隆抗体测定单克隆病（M蛋白），则抗原相对过剩（单一抗原决定簇成分），致使沉淀圈呈不相关的扩大，从而造成某一成分的伪性增加。影响因素

2008-12-18第一实验室双向扩散——结果分析123

2008-12-18第一实验室双向扩散——结果分析加样时有些液体从孔中溢出孔中量不足10μl在湿盒中