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β-羟丁酸诱导内质网应激导致牛乳腺上皮细胞脂质沉积的研究

摘要：为了探究β-羟丁酸（β-hydroxybu-tyricacid，BHBA）是否参与诱导内质网应激导致牛乳腺上皮细胞脂质沉积，试验首先向牛乳腺上皮细胞中添加BHBA，运用实时荧光定量PCR和Western-blot方法检测BHBA对内质网应激标志分子GRP78基因及其蛋白以及脂肪从头合成SREBP1[20]、FASN基因及其蛋白表达水平的影响[20]；然后应用毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）刺激牛乳腺上皮细胞，确定脂质沉积和内质网应激顺序，以此确定是否为内质网应激导致的细胞脂质沉积[20]。结果表明[20]：向细胞中添加BHBA后，内质网应激标志分子GRP78及脂肪从头合成SREBP1[20]、FASN的基因及其蛋白表达水平均升高，并在细胞中添加毒胡萝卜素后这几种基因的表达水平也升高[20]。说明BHBA可诱导牛乳腺上皮细胞发生内质网应激，导致脂质沉积[20]。

关键词:奶牛；乳腺上皮细胞；内质网应激；β-羟丁酸；脂肪从头合成；毒胡萝卜素

前言

奶牛的围产期一般指在生产前的3个星期至生产后的3个星期这一时间范围内，这一时期是奶牛生产过程中的关键时期。围产期奶牛可通过摄取饲料中的糖为自身各项生命活动提供能量[20]。但由于奶牛在产后处于能量负平衡状态造成酮体沉积，使奶牛食欲下降，从而导致产奶量下降且更易受感染和患各种疾病[20]。这通常会导致兽医治疗成本增加、奶牛产奶量减少和产犊时间间隔延长等一系列问题。产后的奶牛由于食量下降及泌乳需求产生导致的葡萄糖的需求量上升，造成奶牛摄入能量不能满足一系列生命活动能量所需，即能量负平衡状态(NEB)。在泌乳早期，产奶量、乳蛋白、脂肪和乳糖合成迅速增加，与此同时饲料干物质摄入量下降高达40%，奶牛脂肪动员有助于弥补干物质摄入量(DMI)的减少，从而导致奶牛机体能量供应不足，从而调动其体内脂肪组织水解生成脂肪酸，进而导致血液中非酯化脂肪酸的增加。脂肪酸在肝脏中生成脂肪酰基辅酶A，与葡萄糖生成的草酰乙酸一同进入线粒体内并参与三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCAcycle）完全氧化分解为细胞提供能量。但在葡萄糖的摄入量不能够满足奶牛一系列生命活动能量所需时，就会造成草酰乙酸的合成不足，进而导致脂酰辅酶A的沉积，沉积的脂酰辅酶A就会生成酮体（如乙酰乙酸、β-羟丁酸、丙酮），酮体在反刍动物代谢过程中起着重要的作用。葡萄糖是机体代谢重要的供能物质，当体内葡萄糖水平下降，酮体就成为了外周组织重要的供能形式。肝脏内脂肪酸堆积通常

会导致脂质增多和高血酮症，而高脂质和高血酮即为奶牛负能量平衡（Negativeenergybalance,NEB）的标志。此类物质在细胞内堆积，就会造成奶牛的酮病[1]。酮病是奶牛围产期一种高发的营养代谢疾病，高发于奶牛妊娠后期与泌乳初期，其会导致奶牛食欲下降，在酮体不断沉积的恶性循环中对奶牛产生不良影响，从而导致围产期奶牛产奶量下降，且更易受感染和患譬如乳房炎等的各种疾病，致使奶牛的淘汰率大大提高，使用年限大大降低，造成奶牛养殖业巨大的经济损失[2]。酮病也会在看似健康的奶牛中发生。目前，奶牛酮病的治疗方式大多为补充葡萄糖以缓解酮体积累，我们期待以其他更有效的方式对抗酮病。牛乳腺是由数百万个分泌细胞组成的外分泌腺，被称为乳腺上皮细胞(MEC)，它认为是奶牛产奶的主要功能单位。牛乳腺上皮细胞的数量及其分泌活性决定了奶牛泌乳期的产

奶量。因此，阐明调控酮病奶牛乳腺上皮细胞应激机制对维持最佳产奶量至关重要。β-羟丁酸（β-hydroxybutyricacid，BHBA）是脂类生成的前体物质之一，少量BHBA可促进乳脂合成，而大量BHBA会抑制乳脂合成[3、20]。

BHBA作为检测酮病奶牛血液生化指标的标准一般为在0-1.2/1.4mmol/L范围之间的奶牛为健康奶牛，而处于1.2/1.4-3.0mmol/L这个范围之间的奶牛我们通常认为它们是亚临床酮病奶牛在，在BHBA浓度为3.0mmol/L以上的奶牛我们通常认为其为临床酮病奶牛。

内质网是细胞中最大的细胞器，其承载着Ca2+储存、分泌蛋白及膜蛋白合成、加工折叠和翻译后修饰以及糖类和脂质合成代谢等功能。当细胞受到刺激时，大量错误折叠蛋白质会在内质网中被加工出来，与未折叠蛋白质混合在一起，引起内质网启动自我保护机制[20]，即为内质网应激[4-5]。而内质网应激中主要反应为未折叠蛋白反应

（unfoldedproteinreaction，UPR），其通过使细胞启动一系列反应如降低翻译水平、诱导调控相关蛋白表达的基因如GRP78表达等方式促进错误蛋白修正、促进泛素-蛋白酶体系统（UPS）加速对未