耐热菌的ELISA快速检测方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN101566632A

(43)申请公布日2009.10.28

(21)申请号CN200910022897.7

(22)申请日2009.06.10

(71)申请人陕西师范大学

地址710062陕西省西安市长安南路199号(食品工程与营养科学学院)

(72)发明人李建科王峰余朝舟

(74)专利代理机构西安集思得知识产权代理有限公司

代理人张晋吉

(51)Int.CI

G01N33/569

G01N33/543

G01N33/531

G01N21/31

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

耐热菌的ELISA快速检测方法

(57)摘要

本发明涉及一种耐热菌的ELISA快

速检测方法，目前采用的细菌平皿培养记

数法，检测周期长，PCR及QC－PCR检

测方法步骤较繁锁。本发明解决了目前耐

热菌检测方法存在的缺陷。操作步骤为：

耐热菌捕集→预增菌→包被酶标板→封闭

酶标板→加耐热菌多克隆抗体→加酶标抗

体→加底物工作液→酶标仪测定。由于每

步均有冲洗步骤，因此若样品中不含耐热

菌，则耐热菌多克隆抗体、酶标抗体被洗

掉；若样品中含有耐热菌，经过预增菌可

达到所需检测浓度，最终使底物显色而呈

阳性反应。本发明简便易行，检测限达国

际标准，可满足苹果浓缩汁中耐热菌不超

过1个/10mL的检测标准，操作过程可在

24小时内完成，达到快速检测的效果。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.耐热菌的ELISA快速检测方法，其特征是按以下操作步骤进行：

耐热菌的捕集；

耐热菌预增菌；

耐热菌包被酶标板；

封闭酶标板；

加耐热菌多克隆抗体；

加酶标抗体；

加底物工作液；

酶标仪测定。

2.根据权利要求1所述的耐热菌的ELISA快速检测方法，其特征是按以下具体操作

步骤进行：

2.a耐热菌的捕集

2.a.1取10-20g待检苹果浓缩汁，以无菌水适度稀释，

2.a.2用溶剂过滤器过滤捕集耐热菌，滤膜孔径0.45μm，

2.a.3耐热菌被截留于滤膜表面；

2.b耐热菌预增菌

2.b.1采用402培养基预增菌14-15h，使培养液中耐热菌浓度达到5×10sup4/sup

个/mL以上，

2.b.2将增菌后的培养液以10000-12000rpm/min，离心10-15min；

2.c耐热菌包被酶标板

2.c.1用0.05mol/L、pH9.6的碳酸缓冲液制成菌悬液作为包被液，

2.c.2将包被液均匀加到酶标板中，每孔100-150μL，

2.c.3酶标板在55-60℃烘箱中2-3h烘干，

2.c.4用0.01mol/L，pH7.4的PBS-吐温20洗板，

2.c.5每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次，

2.c.6洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；

2.d封闭酶标板

2.d.1封闭液为5％-8％的脱脂奶粉，

2.d.2将封闭液均匀的加到酶标板各孔中，每孔200-300μL，

2.d.3在37℃温箱中孵育2-3h，

2.d.4洗板

2.d.4.1用0.01mol/L、pH7.4的PBS-吐温20洗板

2.d.4.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次

2.d.4.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；

2.e加耐热菌多克隆抗体

2.e.1耐热菌多克隆抗体为免疫大白兔得到的多克隆抗体，

2.e.2免疫程序为：

2.e.2.1给大白兔耳静脉注射耐热菌，注射的耐热菌浓度为1×10sup8/sup-

1×10sup9/sup个/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量为

0.5m