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蛋白酶活性测定方法及原理
罗老师
组员
宁舒婷
陈丽君
陈海梅
王熙栋
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第1页
各种测定方法及原理
考马斯亮蓝法
甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法
DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法
福林酚法
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第2页
甲醛滴定法
3
考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中碱性氨基酸（尤其是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰位置由465nm变为595nm，溶液颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
考马斯亮蓝法
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第3页
4
蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成氨基酸，从而测定其酶活。
考马斯亮蓝法
甲醛滴定法
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第4页
5
用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定可溶性红色螯合物，而锌离子可快速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选取适当浓度锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。
考马斯亮蓝法
DHT-酪蛋白法
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第5页
6
溴乙锭插入双链DNA碱基对之间时，可使DNA荧光增加25倍。靠近饱和溴乙锭(0.5µg/mL)与DNA混合时，其荧光增加量与DNA浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上组蛋白，使DNA结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。经过测定DNA溶液荧光增量来计算蛋白酶活性。
考马斯亮蓝法
DNA-溴乙锭荧光分析法
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第6页
7
酶底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解地方，出现透明圆圈。酶活性高低与透明圆圈面积成正比。测定圆圈面积以测定蛋白酶活性。。
考马斯亮蓝法
X-光胶片法
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第7页
8
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。
考马斯亮蓝法
福林酚法
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第8页
福林酚法测定蛋白酶活性
蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。因为蛋白质中含有含有酚基氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），所以，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸呈色反应，来间接测定蛋白酶活力。
蛋白酶活性的测定方法和原理专家讲座
第9页
分析天平：精度0.0001g
恒温水浴：精度±0.2℃
计时表
分光光度计
沸水浴器
振荡混合器
pH计:精度0.01pH单位
乳酸缓冲液（pH=3.0）适合用于酸性蛋白酶
磷酸缓冲液（pH=7.5）适合用于中性蛋白酶
硼酸缓冲液(pH=10.5)适合用于碱性蛋白酶
0.4mol/L碳酸钠溶液
0.4mol/L三氯醋酸液
0.5mol/LNaOH
10.00mg/ml酪素溶液
100μg/ml酪氨酸标准溶液
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第10页
标准曲线绘制
试管0
试管1
试管2
试管3
试管4
试管5
100μg/ml酪氨溶液（ml）
O
1
2
3
4
5
蒸馏水（ml）
10
9
8
7
6
5
酪氨酸实际浓度（μg/ml）
O
10
20
30
40
50
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时酪氨酸量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。
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试验步骤
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第12页
蛋白酶活性计算
K：吸光常数
Title
1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、
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