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埃博拉病毒核酸检测方法

一、目的

埃博拉病毒核酸的提取及PCR检测。

二、适用范围

适用于检测血标本中埃博拉病毒核酸。

三、实验前准备

核对被检样品，包括患者的姓名、编号及检测项目等。

四、检测仪器设备和材料

实时定量核酸扩增检测仪，常规核酸扩增检测仪，RNA提取

试剂盒，一步法RT-PCR扩增试剂盒，一步法实时定量RT-PCR扩

增试剂盒等。

五、实验步骤

（一）实验准备

1.埃博拉病毒相关感染性材料灭活要求在BSL-3级实验室

生物安全柜内操作，灭活材料的核酸提取可在BSL-2级实验室内

进行，核酸PCR扩增可在BSL-1级实验室内进行。

2.进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。预约

实验场所。

（二）RNA的提取（两种方法，可选任一方法进行核酸提取）

RNA提取方法一（5.2.1～5.2.3）

使用TRIzol(或TriPure)试剂以及QIAampViralRNAMini

１

试剂盒提取血标本中病毒RNA。

1.试剂准备：

a.TRIzol（或TriPure）试剂避光保存于2-25℃。QIAamp

ViralRNAMini试剂盒室温（15～25℃）保存；

b.96～100%无水乙醇；

c.1.5ml离心管；

d.带滤芯的灭菌无RNase的移液枪头；

e.台式离心机（适用于1.5ml离心管的转头）；

f.缓冲液AW1和AW2在第一次使用前要按照试剂盒说明书加

入适量无水乙醇稀释；

g.加入310μlAVE至冻干的CarrierRNA中，充分溶解后分

装保存于-20℃，每份分装保存的CarrierRNA不能冻融超过三次。

2.埃博拉病毒相关感染性标本灭活，应在BSL-3实验室Ⅱ级

生物安全柜内进行。

a.吸取700μlTRIzol（或TriPure）至带螺旋口的离心管中，

每管加入5.6μlCarrierRNA。

b.向上述的裂解液中加入70μl样品，盖好盖后，轻轻的上

下颠倒混匀10次，室温孵育不少于10分钟（为避免产生气溶胶，

不要使用震荡仪或摇动离心管混匀）。

c.将管浸入消毒液中3～5分钟，彻底消毒管外壁,然后擦干

净,简单离心使离心管顶端液体落到底部。如需将灭活样本转运

至BSL-2实验室进行病毒RNA提取，将样本裂解液转移至新管中,

颠倒10次以保证管内部充分灭活，然后将裂解样本管浸入消毒液

中3～5分钟，彻底消毒管外壁,然后擦干净,将裂解样本管放入防

２

漏保存装置中，可将管移出生物安全柜进行转运或冻存。6小时

内可在2～8℃保存，6小时以上至2周可在-20℃保存，超过2

周需在-80℃保存，应避免反复冻融。

3.RNA提取，可在BSL-２实验室内进行。

a．在裂解样本管内加入620μl96～100％的乙醇，轻轻的

上下颠倒混匀10次，再简单离心。

b.小心将700μl液体加入QIAampMiniSpinColumn中，盖

好盖，8000rpm/min离心1min,弃去收集管，将柱子置于一新的

2ml收集管上。

c.打开QIAampMiniSpinColumn的盖子，重复步骤5.2.3b，

直至完成全部样品离心。

d.打开盖子，向柱中加入500μlAW1缓冲液，盖好盖，

8000rpm/min离心1min，弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收

集管上。

e.打开盖子，加入500μlAW2缓冲液，盖好盖，14000rpm/min

离心3min。

f.将柱子置于一新的2ml收集管上，空离1min。

g.将柱子置于一新的1.5ml离心管上，加入50μlAVE洗脱

缓冲液，室温孵育1min,8000rpm/min离心1min。离心液即为病

毒RNA