短小芽孢杆菌.pdfVIP

产高活性抗凝溶栓双活性蛋白的短小芽孢杆菌的筛选及鉴定

摘要:

【目的】筛选可产生抗血栓活性物质的细菌。

【方法】利用VY/4平板、酪蛋白平板从水样、土样、兔粪、羊粪、朽木等20多个样品中筛选目的

菌株;利用纤维蛋白平板和纤维蛋白试管检测抗血栓活性;利用形态学特征、理化性质、16SrRNA序

列同源性鉴定目的菌株。

【结果】得到5株可产生抗血栓活性物质的细菌，重点研究了菌株LDS33，发现其分泌的胞外蛋白在

纤维蛋白平板上和纤维蛋白试管中均显示出强烈的溶栓活性，通过试管法发现此蛋白质同时具有较

强的抗凝活性。结合形态学、理化性质、16SrDNA序列及进化树分析，发现该菌株属于硬壁菌门芽

孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌，将其命名为BacilluspumilusLDS．33。

【结论】短小芽孢杆菌LDS33可产生高活性的抗凝溶栓双活性蛋白。

关键词:短小芽孢杆菌，抗凝，溶栓，筛选，鉴定

血栓栓塞性疾病涉及到心血管科、肾脏科、神经内科等多个领域，是致死或致残、加速人体衰老过程

的直接原因和罪魁祸首。全身哪里有血管，哪里就可能发生血栓。因此，防治血栓已经成为世界各国

最关心的问题之一。

溶栓抗凝疗法治疗血栓性疾病是效果最好的治疗手段之一，所以抗血栓药物的发展对控制血栓病人

的死亡率和致残率起到了十分重要的作用。目前，临床上治疗血栓病的抗凝药物大部分作用单一，要

么只有溶栓作用，要么只有抗凝作用，抗凝、溶栓药物需要分别给药，临床应用过程中有许多不便之

处，所以寻找溶栓活性高、副作用小、具有溶栓和抗凝双活性的药物已逐渐成为全世界医药行业的研

究热点。短小芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，产生活性物质的概率很高，不但可以产生多种酶，如耐热木

聚糖酶、耐热丝氨酸碱性蛋白酶、谷氨酰内肽酶、胆红素氧化酶、胶原蛋白酶、碱性纤维素酶、脂肪

酶、耐热角蛋白酶、降解毒死蜱的酶、降解石油的酶、降解血红蛋白的酶等，而且还可以产生多种抗

生素，特别是抗真菌的抗生素。所以为了寻找新的抗血栓药物，同时发掘短小芽孢杆菌的新用途，本

课题组从成都市周边的水样、土样、朽木等样品中筛选具有抗凝溶栓双活性物质的短小芽孢杆菌菌株。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1样品:采自成都市区、洛带古镇、龙泉驿区、双流县、黄龙溪古镇等地的兔粪、羊粪、泥土、

水、朽木等共20个样品。样品采回后风干，马上使用。

1.1.2培养基:VY/4固体培养基，种子培养基和VY/4固体培养基的成分相同，但不加琼脂粉;

［

发酵培养基和酪蛋白培养基。

1.1.3主要试剂和仪器:安琪酵母，维生素B(BR)，N-苯甲酰基甘氨酸钠(BR)，明胶(BR)，尿激

12

酶(采用注射用尿激酶，100000U/支)，凝血酶(采用注射用凝血酶，500U/支，纤维蛋白原1g/

瓶，UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，UNIQ-10柱式胶回收试剂盒;SWCJ-1D洁净工作台，

DH-400型电热恒温培养箱;全温振荡培养箱，奥林巴斯生物显微镜CX21BlM-SET6，PCR反应扩增仪，

3730测序列分析仪，YXJ-2离心机，H6-1微型电泳槽，凝胶成像系统，U-3010紫外-可见分光光

度计，移液器。

1.2目的菌株的筛选

1.2.1样品的预处理:取样品适量，用抗真菌药30mg/L的多菌灵溶液浸泡(水样没有用多菌灵处

理)。

1.2.2VY/4平板法:将用多菌灵处理过的兔粪、羊粪、泥土、树皮、朽木及没有用多菌灵处理过

的水样放入加有30mg/L多菌灵的VY/4平板上，置30℃恒温保湿培养，并及时挑取疑似短小芽孢

杆菌的菌落，转接于VY/4平板上，继续置30℃恒温保湿培养，并反复转接于VY/4平板上培养，

直到目测没有杂菌为止。

1.2.3酪蛋白平板法:将疑似菌株接种在酪蛋白平板上，30℃恒温保湿培养。观察是否有透明圈并

测量透明圈直径大小，有透明圈者则证明该菌株可能产生纤溶酶，透明圈直径(D)与菌落直径(d)

之比(D/d)越大，其酶活性越高。

1.3目的菌