水飞蓟护肝胶囊增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用.docx

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水飞蓟护肝胶囊增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

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摘要：研究水飞蓟护肝胶囊增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。结果显示高剂量组碳廓清吞噬指数（a）、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数及小鼠NK细胞活性明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。酒精性肝损伤模型建立成功，试验后与模型对照组（0g/kg·BW）比较，各剂量组肝组织中丙二醛含量均显著降低（P0.05，P0.01），中、高剂量组肝组织中GSH含量显著升高（P0.05）。高剂量组肝组织中TG含量、肝组织中脂肪变性平均分显著降低（P0.05）。表明水飞蓟护肝胶囊有明显的增强免疫力作用,同时具有对化学性肝损伤有辅助保护作用。

关键词：水飞蓟，灵芝，化学性肝损伤，免疫

肝脏免疫系统包含了众多的固有天然免疫细胞,如巨噬细胞、NK细胞和NKT细胞。这些细胞群体大量聚集在肝脏中,表明它们在肝脏生物学中具有重要的地位,能够为机体提供抵抗外来抗原入侵的免疫监视及保护作用[1]。水飞蓟护肝胶囊为水飞蓟提取物、葛根提取物、灵芝提取物、五味子提取物配伍使用，遵循中医理论，本文研究了其增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。

1仪器与试药

紫外可见分光光度计（XTL-2400）；冰冻切片机（LEICACM510）、病理显微镜（DM4000B）、电子分析天平、半自动生化分析仪、酶标仪、二氧化碳培养箱、显微镜等。全自动生化分析仪（TBA-120FR）等。ICR健康雄性小鼠，体重18~22g。水飞蓟护肝胶囊（自制，0.4g/粒，2.4g/日，葛根提取物：五味子提取物：灵芝提取物：水飞蓟提取物：辅料按照一定比例2:1:1:0.66:11.34混合后装胶囊制成）

2方法

2.1剂量设计

免疫试验分别为溶剂对照组、低、中、高剂量组，低、中、高剂量组，每组10只，按照人体推荐剂量的5,10,30倍设计，分别为0.2、0.4、1.2g/（kg·BW），动物灌胃按0.2ml/（10g·BW）体积给予，对照组给予等体积纯水。每天灌胃1次，连续灌胃30d，进行各项指标的测定。护肝试验选用酒精性肝损伤模型，随机平均分成5组，3个剂量组0.2、0.4、1.2g/（kg·BW），同时设空白对照组（0g/kg·BW）和模型对照组（0g/kg·BW）,小鼠灌胃体积为10mL/kg·BW。每组10只，用无菌水代替受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。连续灌胃30d。

2.2方法

2.2.1小鼠碳廓清实验末次给予受检样品后第2天，小鼠尾静脉注射以生理盐水4倍稀释的印度墨汁，每10g体重注射0.1mL，墨汁注射后立即计时。于注射墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血30μL，加入到3mL0.1%Na2CO3溶液中，摇匀。以0.1%Na2CO3作空白对照，用723分光光度计在600nm波长处，比色测光密度值（OD）。将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数a。

2.2.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验末次给予受检样品后第2天，小鼠腹腔注射20%（v/v，用生理盐水配制）鸡红细胞（2000r/min，离心10min）悬液1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，仰位固定于鼠板上，正中切开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。取腹腔巨噬细胞洗液1mL，平均分滴在2张载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗以去除未贴片细胞。晾干，以甲醇∶丙酮（1∶1）固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸盐缓冲液染色。用纯水漂洗晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：吞噬率%=（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数）×100；吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。

2.2.3NK细胞活性测定实验末次给予受检样品后第2天，将小鼠颈椎脱臼

处死，无菌取脾，用注射器吸取少量Hank’s液轻轻吹出脾细胞，制成单个细胞悬液。用无菌Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1640完全培养液中，台盼蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），调细胞浓度为2×107个/mL。此细胞为效应细胞。试验前24h将YAC-1细胞进行传代培养，用前以Hank’s液洗3次，用1640完全培养液调细胞浓度为4×105个/mL，此细胞为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中：靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton液各100μL。上述各项均设三个平行孔，5%CO2，3