化妆品中粪大肠菌群检验技术原理及要点分析.docx

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化妆品中粪大肠菌群检验技术原理及要点分析

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何慧贞

摘要：粪大肠菌群这一组群细菌中大肠，埃希氏菌(Ecoli)数量最多，是较理想的指示菌，但欲正确鉴定此细菌，手续较繁复，因此在化妆品检验中采用粪大肠菌群列为重要的卫生指标菌1。检验人员对这项目的检验技术要求细节存在着的这样那样的问题，直接影响了检验结果报告，本人就一些技术上的问题进行了初步的分析。

关键词：化妆品；粪大肠菌群；检验原理；要点分析

中华人民共和国卫生部在1987—7—1就颁布实施了在化妆品中必须要检测粪大肠菌群，但许多检验人员对这项目的检验技术要求细节存在着的这样那样的问题，直接影响了检验结果报告，所以本人结合在培训过程中学员遇到的一些技术细节问题进行了初步的分析，提出了一些建议望各位老师指教。

粪大肠菌群为总大肠菌群的一个亚种；粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。考虑到总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境(水与土壤)中亦经常存在。在粪大肠菌群这一组群细菌中大肠埃希氏菌(E.coli)数量最多，是较理想的指示菌，但欲正确鉴定此细菌，手续较繁复，因此在化妆品检验中采用粪大肠菌群列为重要的卫生指标菌。

大家先来看看简单的操作步骤：

检验原理及要点分析：

(1)将接种好的样品放人恒温水浴箱或隔水式恒温培养箱时，箱内温度一定要求达到所要求的温度(44±1℃)时，方可放入。因自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25℃左右，如在37℃培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44.5℃，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌也就是粪大肠菌群，习惯于37C左右生长，如将培养温度升高至44.5℃仍可继续生长。因此，可用提高培养温度方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分。如用恒温水浴箱其水面要高于接种物面，放滤膜的培养皿要沉到水浴箱底部。

(2)本方法采用乳糖胆盐培养液，是具有选择性作用的培养基。其中胆盐具有抑制革兰氏阳性菌的作用。胆盐的品种来源及用量不同，其抑菌效果也不同。经实验观察，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果无明显、差异，可互相替代；而其他胆盐的检验效果则不一致。不宜相互代替2。

取loreL1:10稀释的检液，加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养液中(提高灵敏度和增菌的作用)，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。

(3)乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖并产酸产气。大肠杆菌能分解乳糖而产生酸，使培养基的pH降低(指示剂变色)。这一现象可作为观察结果的指标。大肠杆菌细胞在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2，在培养基中产生大量气体而进入倒管中，以观察产气2。

实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂，细菌产酸后，培养液即由原来的紫色变成黄色。

(4)双倍浓度的乳糖胆盐

培养液应尽快放于高压蒸汽灭菌器中，在68.95KPaIl5℃灭菌20min(注意：这个温度也应控制好，既达到灭菌的作用，还要防止培养物质分解流失)，然后贮存于水箱或暗处备用。

(5)如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置3TC培养L8h～24h。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。影响粪大肠菌群检出率的因素很多。如化妆品种类，菌落色泽和形态，细菌种类等，如只挑一个菌落，由于机率问题，很难避免假阴性出现，所以当菌落呈不典型时，要多挑几个菌落以免出现假阴性2。

表1粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征3

培养基

菌落特征伊红美国微软紫黑色、有金属光泽，紫黑色、公司兰培养基不带或略带光泽，淡紫红色、中

(EMB)

心紫黑色、黑红或深紫红色中国兰平板深蓝色，浅蓝色、中心深蓝色桃红色，粉红色、中心桃红色

挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s4。

(6)双倍浓度的乳糖胆盐培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h。经培养后，在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈-玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色