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证明细胞单克隆性的几种方法

细胞株对药物开发的重要性

细胞株是生物药物工艺开发的起点和基础，后续工艺开发、临床前和临床工作都是基于某一确定的细胞株进行开展。同时，细胞株产量会影响到生产的成本，质量会影响到药物的安全性和有效性。细胞株开发过程速度、合规性影响到药物开发的进度和成败。

ICHQ5D提到，用于商业化生产的工程细胞株需要源于单一原始细胞。进行单克隆源是为了减少细胞库的异质性，保持生产过程的一致性和可预见性，确保最终产品的产量和质量在预设的范围。

单克隆源性不等于细胞库的均质性

CHO细胞的DNA修复机制不完善，来源于单一原始细胞的细胞株在生长分裂过程中可能会有遗传和性状的改变，绝大部分的细胞库都存在不同程度的异质性，同时，从单一原始细胞到最终生产过程细胞处于动态变化过程，细胞的克隆和扩增传代过程对于细胞株在生产过程的表现有很大影响。

监管机构对单克隆源性的要求

单克隆源性不是IND/BLA批准的必要条件，但是监管机构一般期望生产细胞株来源于单一原始细胞。早期细胞株克隆技术以有限稀释为主，两轮有限稀释是被监管机构接受的方法，满足单克隆源性要求。2013年左右FDA开始强调细胞株的单克隆源性，涉及很多公司大量细胞株克隆方法被FDA认为不满足单克隆源性。

单克隆源性工业界观点

生产的最终目的是保证最终产品的安全和有效，这依赖于对生产过程的控制和最终产品的分析。单克隆源性不能保证生产过程和最终产品的一致性，监管机构不应过分强调单克隆源性，应该把重点放在生产过程的控制和最终产品的分析上。

FlorianWurm2017年发表文章阐述对单克隆源性的看法。CHO细胞生长过程广泛存在基因突变，遗传和性状改变是CHO细胞生长过程常见现象，即使从单一原始细胞生长而来的CHO细胞也存在遗传和性状的不均质性。克隆细胞株实际上更类似于quasi-species：一个存在高频突变，不断变化的细胞群体。

FDA的观点

FDA承认单克隆源性不等于细胞株的遗传均一性，最终产品的产量和质量的控制来源于对生产过程的整体控制策略。细胞株单克隆源性是整体控制策略的一部分，非单克隆源性的细胞株在工艺变更的时候可能有更高的不确定性，因此缺乏单克隆源性证据会使得风险评估变得更加困难。

IND/BLA阶段的细胞株克隆源性要求

在申报IND的时候需要提交关于细胞株克隆过程的描述以及单克隆源性证据。监管机构会对过程描述和证据进行初步评估，如果有重大缺失，会与申报方进行沟通，在BLA申报时需要提交单克隆源性的完整证据。此外，IND申报时，缺乏单克隆源性证据并不意味着申报不通过。

监管机构认可的概率证据：监管机构没有明确规定可接受的概率，在合适的铺板密度下两轮有效稀释是可以接受的，孔板照相可以作为补充证据。

孔板照相设备的应用

孔板照相经历了10年的发展，已被监管机构认可并且广泛应用。在合适的铺板方法下，一轮细胞克隆加孔板照相可以满足单克隆源性要求。铺板方法可以是有效稀释（铺板密度≤0.5cell/well，实际操作中，考虑操作误差一般按照0.5cell/well）。孔板照相需要在第0天，拍摄清晰的单个细胞存在，在第1天和第2天再次拍照捕捉细胞分裂过程。

新技术和设备在提供单克隆源性证据中的应用

1、单细胞铺板技术：提高铺板效率，提供额外单克隆源性证据，配合照相设备使用。

如Cytena，VIPS，Namocell，WOLF等。

2、微流控技术：高通量细胞筛选，，同时获取单克隆源性证据，不需要另外照相。

如Beacon，Cyto-mine等。

常用的单细胞克隆方法

1、两轮有限稀释：铺板密度在0.5cell/well或以下，操作简单但是耗时较长。

2、两轮clonepix：在一定的细胞密度下，耗时长。

3、一轮有限稀释加孔板孔板照相。

4、单细胞铺板加孔板照相：FACS、singlecellprinter、VIPS。

单细胞克隆系统的验证

1、对于基于有限稀释法的方法验证：实际铺板密度与计算铺板密度相符；细胞分布符合泊松分布。

2、对于孔板照相设备的验证主要关注第0天实际存在但未被照相设备观察到的细胞，可以通过统计幽灵（ghostwell）的比例进行估算。（幽灵孔，指铺板当天未观察到，但其后有细胞生长的孔）

3、红绿细胞混合克隆混合克隆实验：把表达GFP和RFP的细胞等比例混合培养以后进行单细胞克隆，统计被认为是单克隆但实际有红绿荧光的克隆比例。

单克隆源性的事后证明

Lowprobability+HighAssurance→Acceptable，通过亚克隆分析确定；产量、细胞生长参数、产品质量、基因拷贝数等都不是可靠的单克隆源性证据，独特的遗传学特征（质粒整合位点、质粒间接，质粒重排）才可以作为单克隆源性证据。独特的遗传学特征是独一无二