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第二章固定化酶一、什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶性酶（固定化酶）1

二、固定化酶的特点l优点：–不溶于水，易于与产物分离；–可反复使用；–可装塔连续化生产；–稳定性好。l缺点：-固定化过程中往往会引起酶的失活-首次投入成本高-大分子底物较困难2

三、固定化酶的方法?（一）吸附法?（二）结合法?（三）交联法?（四）包埋法3

（一）吸附法?物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。选择载体的原则:-要有巨大的比表面积-要有活泼的表面-便于装柱进行连续反应物理吸附法:-静止法-电沉积法-反应器上直接吸附法-混合浴或振荡浴吸附法4

优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱，易解吸附。载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。5

（二）结合法?1离子键结合法?2共价键结合法6

1离子键结合法?酶分子含有离子交换基团的固相载体?第一个离子结合法固定化酶：?DEAE—Cellulose?固定化过氧化氢酶?第一个工业化的固定化酶：?DEAE-SephadexA-50?固定化氨基酰化酶?常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶?使用注意：pH、离子强度、温度7

2共价键结合法?（1）概念?（2）可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键?（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体8

共价键结合法制备固定化酶的“通式”?首先载体上引进活泼基团??然后活化该活泼基团?最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键9

（4）载体活化的方法?A．重氮法(需载体具有芳香族氨基)?B．叠氮法?C．烷基化反应法?D．硅烷化法?E．溴化氰法10

（三）交联法?交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。?常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛。11

双功能试剂：常用的是戊二醛OOH—C—CH—CH—CH—C—H222戊二醛的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶12

图酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联?酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶。13

?交联法有2种形式：酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。14

双重固定法：（1）吸附交联法?先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。15

（2）交联包埋法?把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。16

（四）包埋法（entrappingmethod）l定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中使酶固定化的方法。l分为：网格型和微囊型17

1．网格型?将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶的方法。也称为凝胶包埋法。18

2．微囊型包埋法?将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。19

各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易固定化程度活力回收率载体再生费用易弱难强易较难强较难强中等高较高可能低低中等不可能中等可变高不可能高可能低不可能低底物专一性不变可变不变不变小分子底物、药用酶适用性酶源多较广广泛较广20

固定化后酶的考察项目：?（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。?（2）考察固定化酶稳定性。?（3）考察固定化酶最适反应条件。21

评价固定化酶的指标:?1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。?或：单位面积（cm）的2酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。?2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最