原创力文档- 1、本文档共8页，可阅读全部内容。
- 2、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 6、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
水稻转基因实验操作手册整理--第1页
水稻转基因实验操作
一、水稻愈伤组织的诱导（）
以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织
1．消毒：
取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：
1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；
2）倒去酒精，加入100ml3%次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），
放入摇床振荡60分钟；
3)倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；
2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；
3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密
呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。(没有脱落的可在
原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)
二、预培养
将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。预培养基碳源
为20克蔗糖+20ml50%葡萄糖（115度灭菌30min）。乙酰丁香酮（AS）浓度为100μM(每
毫升培养液中加入100mM的AS1微升)
三、农杆菌（工程菌）培养
把-70℃保存的菌种首先用含125mg/L壮观霉素、50mg/L利福平的YEB液体培养
基，在26-28℃，150r/min振荡培养16-18h，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天，用含125mg/L壮观霉素、50mg/L利福平的YEB固体培养基
划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2-3d。3d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体
培养基或者AAM培养基，28℃振荡培养3～4h。分光光度计测定菌液浓度，并将其浓
度调至0.5-1.0OD
600
四、感菌与共培养
1）将预培养后的愈伤组织接入100mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30
分钟，期间摇动数次；
2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；
水稻转基因实验操作手册整理--第1页
水稻转基因实验操作手册整理--第2页
3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。19-20℃（组培
室）暗培养3天。
五、愈伤组织的抗生素筛选
将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗4次，然后加入无菌水浸泡10min,
使愈伤内部的菌体游离出来；倒去洗液，再用含400mg/L头孢的无菌水浸泡20min。再用含
400mg/L头孢的无菌水冲洗一次，最后置于无菌滤纸上沥干3h。
第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含400mg/L羧苄青霉素（Car）和400mg/L头孢霉素
的选择培养基（没有选择压力）上，26℃暗培养5-7天；
然后将愈伤转到含400mg/L羧苄青霉素（Car）、400mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的
培养基上进行选择，26℃，暗培养，两周一次，培养两次。
六、抗性愈伤组织的诱导分化和生根
文档评论（0）