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膀胱癌多药耐药的流式细胞术分析
本实验旨在研究流式细胞术(flowcytometry,FCM)在膀胱癌
细胞的多药耐药分析方面的作用，现报道如下。
一、材料与方法
1.试剂及仪器：DMEM、DNA提取试剂盒DNAzol、RNA提取试
剂盒Trizol为Gibco产品；秋水仙素、甲酰胺、polybrene为Sigma
产品；缺口平移系统(nicktranslation)为Promega产品，尼龙膜为
ZetaProbe产品；鲑鱼精DNA购自晶美生物公司；MDR-1pCR引物P1：
5′CCCATCATTGCAATAGCAGC-3′,P2:5′-CTTCAAACTTCTGCTCC
tGA-3′［1］，由军事医学科学院放射医学研究所合成；抗
P-gp单克隆抗体JSB1购自福州迈新公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自
北京中山生物技术公司；阿霉素由法玛西亚公司福建办事处提供；FCM
检测由北京中医研究院西苑医院流式细胞室完成。
2.细胞株：转导人mdr-1cDNA的逆转录病毒包装细胞
PA317/PHamdr-1/A由本室保存［1］。人膀胱癌细胞株EJ由北京医科
大学泌尿外科研究所提供。以上细胞均生长于DMEM培养基中，其中含
体积分数为10%的胎牛血清和200mmol/L的L-谷氨酰胺，在体积分数
为5%的CO2、37℃培养箱中培养。逆转录病毒转染EJ细胞参照文献［1］
进行。
3.转mdr-1基因细胞系EJ/MDR的鉴定：(1)PCR分析mdr-1
基因的整合：参照DNAzoldNA提取说明书提取EJ/MDR-1细胞基因组
DNA，取1μlDNA用于PCR扩增。50μl体系：200μmol/LdNTPs、
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1.5mmol/LMg2+，2种引物各0.5μmol/L，95℃预变性1min，加
Taq酶2U(Promega公司)。PCR仪上扩增：94℃变性45s，60℃退火
45s，72℃延伸60s，30个循环后72℃延伸7min，2%琼脂糖凝胶电
泳检测167bp特异扩增带。(2)外源基因在转染细胞的表达分析：mdr-1
基因cDNA探针用StuⅠ酶切质粒PHamdr-1/A获得，DIG缺口平移法标
记探针，按Trizol说明书提取细胞总RNA，甲醛变性电泳检测RNA的
质量，紫外吸收法定量，按文献［4］进行RNAdotblot。
4.间接免疫荧光分析：收集对数生长期EJ/Mdr-1及EJ细胞，
PBS洗涤、离心2次。调节细胞浓度至1.0×105个/ml,加入P-gp单
抗JSB115mg/L,4℃放置30min；冷PBS洗2次，加入FITC标记羊抗
鼠IgG，FCM检测P-gp蛋白表达；参照文献［3］行抗体稀释及细胞固
定，4℃继续放置30min；冷PBS洗2次后送检。
5.FCM测定转基因细胞内阿霉素浓度：参照文献［3］进行。
MTT法检测EJ/mdr-1细胞对化疗药物的体外敏感性：参照文献［4］
进行。
二、结果
用PA317/PHamdr-1/A病毒上清转染的EJ细胞，秋水仙素(120
μg/L)加压筛选3周，获得抗性克隆，命名为EJ/mdr-1，培养传代。
提取EJ/mdr-1细胞DNA行PCR检测，可特异性扩增出167bp的mdr-1
基因片段，而其亲代EJ细胞则未扩出此片段，从而证实有mdr-1基因
的整合。提取已转导mdr-1
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