肿瘤细胞培养技术.ppt

免疫方法4.体外免疫：分离小鼠脾细胞，置10%~20%FCSRPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原（可溶性抗原0.5~5?g/ml；细胞性抗原105~106/ml），37℃，5%CO2培养3天，再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。第31页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备一.滋养细胞制备：1.机制：不明，通常认为这类细胞释放一种或几种生长因子，提供必要生长条件。2.小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞⑴正常无感染BALB/C小鼠，处死。⑵75%乙醇浸泡5~10min，第32页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备⑶撕开腹部皮肤，充分暴露腹腔，提起腹膜，剪开，吸管注入5ml无血清培基，小心提动或轻揉腹膜，吸出培基。⑷无血清培基洗2次，细胞浓度2×105/ml,0.1ml/孔/96孔，相当于2×104。通常获2×106~5×106只。第33页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备二.骨髓瘤细胞准备：Sp2/0,NS-1等1.复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。2.培养、传代，取对数生长期细胞（1×105~5×105/ml），按1：5~1：10稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。3.RPMI-1640培基洗3次（1000r/min×5min)第34页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备注意事项：1.骨髓瘤细胞的细胞活数应在〉95%，2.无各种污染，3.骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。第35页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备三.免疫脾细胞悬液制备：1.免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。2.浸泡于75%乙醇5~15分，入超净台，打开腹腔（逐次换器械），取脾。3.剪碎脾脏，注射器内芯研磨过100目钢筛，平皿预先2~3mlRPMI-1640，移入圆底试管，补加适量培基，，静置3~5分，取上2/3悬液移入50ml离心管，上述反复2~3次。第36页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备三.免疫脾细胞悬液制备：5.上述培基洗细胞2次（1000r/min×10min），6.不完全培基10ml重悬液，台盼蓝计数活脾细胞数，1×108~2.5×108/只。第37页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备四.50%PEG的准备：融合前，称PEG（mw=4000)2g，置小瓶内，低压消毒（8磅），15min,取出立即边加边摇加入2ml完全培基，（内含0.3%ml二甲基亚枫，以提高融合率），至完全混合，4℃保存。用前37℃预热。要求PEG现配，防止PH变碱。第38页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备五.细胞融合：1.将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50ml离心管内（脾细胞1×108，骨髓瘤细胞1×107）。用SP2/0时，脾细胞：骨髓瘤细胞以10：1为好；用NS-1，脾细胞：骨髓瘤细胞以5：1为好。第39页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备2.RPMI-1640培基洗2次（1500r/min/8min）；3.倾倒上清，吸尽残留液，轻弹管底，使细胞疏松，离心管移至超净台预先放置的37℃水浴。4.1ml吸管吸取0.8ml37℃PEG，1×108脾细胞+0.8mlPEG，边加边摇，60s内加完，轻摇1.5min。5min内摇动缓和加入10ml预温37℃的RPMI-1640。第40页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备注意：第1min加1ml;第2min加1ml;第3min加1.5ml;第4min加1.5ml;第5min加5ml;再补加40ml。离心：1000r/min/5min.第41页,共49页，星期六，2024年，5月单克隆抗体制备5.移出上清，取少量HAT小心吹散细胞，细胞移入HAT培基中，按免疫脾细胞2×105/