分子生物学常用实验技术及方法.pdf

分分⼦⼦⽣⽣物物学学常常⽤⽤实实验验技技术术及及⽅⽅法法

第⼆章常⽤实验技术及⽅法

⼀、聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)

反应总体积为50µl，其含有：

模板DNA0.5µl

PCR缓冲液(不含MgCl2)5µl

10MgCl2溶液5µl

dNTP(2.5mmol/L)0.5µl

引物1(50umol/L)0.5µl

引物2(50umol/L)0.5µl

TaqDNA聚合酶0.5µl

⽆菌去离⼦⽔加⾄50µl

上层⽤25µl液体⽯蜡油覆盖。

循环参数为：94℃变性10min

94℃变性1min

56℃退⽕1min

72℃延伸2min

共30个循取环，PCR结束后，取2µlPCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。

⼆、基于PCR技术的定点突变

1.根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下

游引物Primer3和Primer4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所⽰）；

2.⽤基因5’端的Primer1和Primer2PCR扩增DNA⽚段1，⽤基因3’端的Primer4和Primer3⼀起PCR扩增DNA⽚段2，PCR

反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA⽚段1和

DNA

⽚段2；

3.以⽚段1和⽚段2为模板，进⾏第⼆次PCR反应，反应体系为50µl：

⽚段11µl

⽚段21µl

10PCR缓冲液(不含MgCl2)5µl

10MgCl2溶液5µl

dNTP(2.5mmol/L)5µl

Taq酶1µl

加ddH2O⾄50µl

在该反应体系先不加⼊引物，按上述反应条件进⾏10个循环，然后再加⼊Primer1和Primer4各1ul，按上述反应条件再扩

增30个循环；

4.PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体，进⾏测序以确定定点突

变的正确性。

三、TotalRNA的提取(Catrimox-14TM

RNAIsolationKitVer.2.11)

1.吸弃培养细胞的旧培养基，⽤PBS洗涤1-2次后，加⼊1ml的Catrimox-14

TM溶液，然后充分混匀；

2.收集细胞裂解液，按以下条件进⾏离⼼：

细胞数5105

：9500rpm(约5000g)5min

细胞数5105

-110

7

：3000rpm(约450g)5min

细胞数1107

：1500rpm(约112.5g)5min

3.除去上层溶液，加⼊1ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后，12000

rpm离⼼2min；

4.吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动；

5.向Microtube加⼊1ml的2MLiCl溶液；

6.激烈振荡后，室温下12000rpm离⼼5min，除去溶液；

7.沉淀⽤70%冷⼄醇清洗⼀次；

8.沉淀经过简单的真空⼲燥后，溶于适当的缓冲液。

四、RT-PCR(TaKaRaOneStepRNAPCRKit)

1.按TakaraKit所提供的标准步骤配制PCR体系；

2.按以下条件进⾏RT-PCR反应

(1)50℃30min

(2)94℃2min

(3)94℃1min

(4)56℃1min

(5)72℃2min

3.重复步骤(3)-(4)-(5)，共30个循环；

4.反应结束后，取3-5µl进⾏琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物冷冻保存。

五、DNA样品的琼脂糖凝胶电泳

50TAE:242gTris碱

57.1ml冰⼄酸

100ml0.5MEDTA(pH8.0)

1.称取0.5gagarose，置于250ml锥形瓶，加⼊50ml1TAE（含EB0.5

ug/ml），加热使其全部溶解；

2.封⼝、安放梳⼦；

3.待凝胶稍凉后铺板；

4.胶凝固后，放⼊电泳槽，倒⼊1TAE，淹没胶⾯，拔去梳⼦；

5.将DNA样品与6的上样缓冲液混合，加于加样孔；

6.80-100V恒压电泳，待