单克隆抗体制备细胞融合实验操作步骤.pdf

单克隆抗体制备细胞融合实验操作步又

牌细胞融合

培养基;

RPMI(500ml):无血清和其它添可物

融合培养基《〈无HAT):

RPMI〈500ml)，2mM谷氨酰胺,1XNEAA〈非必需氨基酸)，1X两酮

酸钠，15%FBS《〈胎牛血清)，1X青链害素溶液，1%杂交瘤克隆因子，1

义OPI

选择培养基一1〈含1XHAT):

RPMI(500ml),2mM谷氨酰胺，1XHAT,1XNEAA(站必需氨基酸)，

1X具酮酸钠，15%FBS《〈胎牛血清)，1X吉链霉素洲液，1%%打交瘤克隆

因子，1xOPl

选择培养基一2〈含2XHAT):

{每次融合15个板需150ml)

RPMICml)，2mM谷氨梧腕，2XHAT，1XNEAA，1X丙酮酸钠，15%

FBS$，1X青链霉素溶液，1%杂交瘤克隆因子，1XOPI

脾细胞处理:

1应用无菌技术从免疫的兔子身上取出脾

2在100mm的培养四中,把脾浸在10ml不含血清的RPMI培养基中

(培养基需是刚从4它冰箱拿山)，并用科网分离脾细胞。

3转移所有的脾细胞到一支50ml的离心管中，并用10ml不含血清的

RPMI培养基洗培养下以收取更多的细胞。

4离心使细胞沉下来，弃去上清，以20ml不含血清的RPMI培养基重

新悬浮细胞，让团块下沉下来，并把不下沉的细胞转移笃，支新的50ml

的离心管中。

5离心使细胞沉下来，以20ml不含血清的RPMI培养基清洗细胞。再

离心“次，以20ml不含血清的RPMI培养基重新营浮细胞，并计数。

66取300X10肿细胞用于一次融合。

同用于融合的骨散癌细胞

1通过离心，收集融合同用的细胞

2弃去上清，并以20ml不含血清的RPMI培养基重悬以洗细胞。再离

心，以20ml不含血清的RPMI培养基重新悬浮细胞，并计数。

63取30X10细胞。

融合

1把兔子御细胞与融合同几的细胞混合在一支50ml的离心管中，并

加不含血清的RPMI培养基至30ml。

2部心下细胞，尽可能地从管壁吸去培养基。轻轻用移液器〈最小程

度)哆细胞小款块，使其松开。

3加1mlPEG，加的过程需大于1分钟。加PEG时，旋转50ml的离心

管使细胞混合好或轻柔地用枪头混人细胞《不用吹打)。

4静置细胞1分钟。

5按2分钟的时间加1ml不含血清的RPMI培养基;按5分钟的时间

加4ml不含血清的RPMI塔养基，按5分钟的时间再加sml;，按5分钟的

时间再如19ml(培养基量和PEG量总共为30ml)。在加培养基的过程中，

旋转离心管，轻柔地混合混合细胞。

6离心细胞，1000rpm，10分钟，吸出培养基。加1ml融合用培养基

《不含HAT)，轻轻吹散成小球，轻柔用移液器弄散大的细胞团块《要注意

不能来回吹打与