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实时菊光定量KR操作步又
以下实验步又仅供参考:
1样品RN的抽提
轧取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
加两相分岗每Im的TRIZT试剂裂解的样品中加入0和1的氧仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30C凡育2到3分钟。筷下12000rpm离心
15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上
层。了RN全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀桨时加入的TRIAL试
剂的6084
二RIRA沉淀将水相上层转移到一十净无RARA酶的离心答中。加等体积异丙醇混
合以沉淀其中的RN混匀后15到30C贱育10分钟后，于亿下12000rpm岗
心10分钟。此时离心前不可见的了沉淀将在管底部和侧辟上形成胶状沉淀块。
四RR清洗移去上清液，每ImIIRIZCL试剂裂解的样品中加入至少lml的73%
乙醇(73纪醉用CEPCHC配制)，清洗RN沉淀。混匀后，人多下7000rpm谢心
5分钟。
加RNA二燥小心吸太人部分乙醇溶液,使RNNI演在室温空气中十燥-10分钟。
轿溶解RS沉淀溶解RS时，先加入无RAR梅的水49，1用枪反复吹打几次，
使其完全溶解，获得的RN溶液保存于-80C待用。
2RAR质量检测
了紫外吸收法测定
Eee
后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RS深液浓度和纯
度。
名浓度测定
入60下读值为1表示40hgRNyhol样品队丰浓度和8计算公式为:A60X
稀释倍数xX40Hgfnl。具体计算如下:
RS党于40H1DEPC水中，取5ul，1100稀释至49$1的TE中，测得A260
0.21
RiR浓度=021x100x40hghl=840hgh如或084u弧1
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35H1剩余RNA总时为:
35hLIX084N8g1=294hg
加纯度检测
Rh溶液的A260人280的比值即为Ra纯度，比值范围18到21
3变性琼脂糖诗胶电泳测定
名制胶
18g防脂糖溶于72m1水中,冷却至60C，10ml的10xMOPS电泳缓冲液和18ml
的376甲醛海液423M。
10xMDPS电泳缓冲液
浓度成分
04MMOEPSBE70
0IM乙酸钠
Q0IMEDTA
灌制凝胶板，顶留加样孔全少可以加入25HN1溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
放入电泳槽肉，加足最的1]xMDPS电泳缓冲液至袜盖胶面几个毫米。
加准备RNA样蜗
取九旺车加3倍体积的甲醛上样染流，加耳于甲醛上样染液中至终浓度为
1gl加热至70C孵育15分钟使样品变性。
国电泳
上样前凝胶须预电泳3min随后将样品加入上样孔。56VAem电压下加电泳
至省酌兰指示剂进胶至少23cm
团紫外透射光下观察并拍赂
28S和18S核糖体RE的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RN
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